Mielių Saccharomyces cerevisiae K2 toksino savybių tyrimas

Abstract

Šio darbo tikslas ištirti – Saccharomyces cerevisiae K2 toksino savybes ir jo poveikį jautrioms mielių ląstelėms. Kileriniai toksinai, tai baltymai, kuriuos sekretuoja kilerinių mielių viduje esančių virusų genomai ir kuriuos ląstelės šeimininkės panaudoja kitų mielių ar bakterijų ţudymui. Eksperimentams buvo naudojami kalio (K+) ir fenildikarbaundekarborano (PCB-) jonams atrankūs elektrodai ir registruojamos šių indikatorinių jonų koncentracijos po inkubacijos su toksinu. Atominės jėgos mikroskopas (AJM) buvo naudojamas nustatyti ląstelės sienelės elastingumą po toksino poveikio. Toksinui koncentruoti buvo naudojamas išsūdymas amonio sulfatu ir jonų mainų chromatografija. Registruojant ląstelėje sukauptą K+ jonų kiekį, nustatyta, kad toksinas sukelia jonų ištekėjimą jau po daugiau nei 10 min., tačiau PCB- jonų sugertis rodo, kad mielių metabolizmą toksinas paţeidţia tik po 30 inkubacijos minučių. Nustatyta, kad toksinas geriausiai veikia, kai inkubavimo terpės pH yra 3-4. Rūgštinėje terpėje išskirtas toksinas negrįţtamai denatūruoja esant pH 7. Atominės jėgos mikroskopu tiriant sienelės elastingumą nustatyta, kad po inkubacijos su toksinu, ląstelės aplimpa 200-300 nm storio baltymų sluoksniu. Šį toksiną galima 100 ir daugiau kartų sukoncentruoti išsūdant amonio sulfatu arba naudojant jonų mainų chromatografiją.

The aim of this work was to investigate effects of Saccharomyces cerevisiae K2 toxin on microbial cells. Killer toxins are proteins which are secreted by killer yeast cells. The toxin genes are encoded in the viral genome, and the host cell uses them for killing of sensitive yeast and other microbial cells. Ion-selective electrodes for potassium (K +) and phenyldicarbaundecarborane (PCB-) were used to register the concentration of these indicator ions in medium of yeast cells after their incubation with the toxin. Atomic force microscope (AFM) was used to determine the cell wall elasticity after the cell interaction with toxin. Salting out with ammonium sulphate and ion exchange chromatography were used to concentrate the toxin. Registering the amount of accumulated intracellular potassium ions it was found that toxin causes K+ leakage after 10 min and longer incubation with toxin, but PCB- binding indicates that yeast metabolism is affected after 30 min and longer incubation. The strongest effect of toxin was observed after the incubation in medium with pH 3-4. However, if toxin is isolated in acidic conditions, transfer to pH 7 leads to irreversible denaturation. The cell wall elasticity scanning using AFM showed that 200-300 nm thick layer of protein gets stuck to the cell surface after incubation toxin-containing medium. It is possible to concentrate the toxin for 100 times by salting out with ammonium sulfate or using ion-exchange chromatography.