Lactococcus lactis ląstelių atsparumo antimikrobiniams junginiams tyrimai

Abstract

Bakterijoms prisitaikant prie kintančios aplinkos ir įgyjant mechanizmus leidžiančius apsisaugoti nuo antimikrobinių preparatų imta nagrinėti Lactococcus lactis bakterijų gebėjimą apsisaugoti nuo lizocimo poveikio apvalkalėliui ir daugiavaisčio atsparumo veikimą, kurio metu antibiotikai ir antimikrobinės medžiagos yra pašalinamos per membranoje lokalizuotus baltyminius darinius – siurblius. Šio darbo tikslas buvo ištirti Lactococcus lactis bakterijų atsparumo lizocimui ir lipofiliniams antibakteriniams junginiams mechanizmus. Darbo metu buvo atrinkta šešiasdešimt lizocimui atsparių MG1363 kamieno mutantų ir vienas lizocimui atsparus NZ9000 kamieno mutantas. Nustatyta, kad inaktyvavus spxB ir cesR genus kamienai VES2822 ir VES2857 praranda atsparumą lizocimui, kanamicinui ir vankomicinui. Geno oatA inaktyvacija VES2822 kamiene neturėjo įtakos jo atsparumui antimikrobinėms medžiagoms, o kamienas VES2857 po oatA geno inaktyvacijos praranda atsparumą lizocimui. Nagrinėjant jonofoninių antibiotikų nigericino ir monensino poveikį daugiavaisčio atsparumo siurbliams nustatyta, kad nigericinas ir monencinas neturi slopinančio poveikio L. lactis daugiavaisčio atsparumo siurblių veiklai, ir šios medžiagos iš ląstelių yra šalinamos kaip daugiavaisčio atsparumo siurblių substratai. Analizuojant gliukozės poveikį ląstelių energizavimui, nustatyta, kad esant mažesnei nei 1,3 mM gliukozės koncentracijai, bakterijos šį sacharidą suvartoja greičiau nei spėja įsijungti daugiavaisčio atsparumo siurbliai. Kai gliukozės koncentracija viršija 0,3 mM galima stebėti kelių TPP+ jonus išmetančių daugiavaisčio atsparumo siurblių palaipsninį įsijungimą. Energizavus ląsteles 11 mM ir didesniais gliukozės priedais, sukeliančiais ilgalaikę ląstelių energizaciją, stebima maksimali daugiavaisčio atsparumo siurblių veikla ir energizacijos pradžioje dėl padidėjusios membranos įtampos sukaupti TPP+ jonai yra pilnai pašalinami iš ląstelių.

During adaptation to the changing environment bacteria acquire mechanisms allowing them to become resistant to antimicrobial agents. The ability of Lactococcus lactis cells to protect themselves from lysozyme-induced lysis and the activity of multidrug resistance pumps, extruding antibiotics and other antimicrobial substances out of the cells were analysed in this diploma project. The aim of this research project was to explore the mechanisms of resistance of Lactococcus lactis cells to lysozyme and lipophilic antibacterial compounds. Sixty lysozyme-resistant MG1363 mutants and one lysozyme-resistant mutant NZ9000 were selected. It was discovered that cells of VES2822 and VES2857 strains lose resistance to lysozyme, kanamycin and vancomycin when spxB and cesR genes are inactivated. Inactivation of oatA gene had no influence of strain VES2822 anti-microbial resistance but after inactivation of the same gene in strain VES2857 resistance to lysozyme was lost. During studies of the effect of ionophoric antibiotics nigericin and monensin on the efflux pumps in L. lactis cells, it was found that nigericin and monencin has no inhibitory effect on the activity of multidrug resistance pump. However, these antibiotics are substrates of the efflux pumps. Analysis of the glucose effects on cell energization showed that multidrug resistance pumps fail to start their activity if the concentracion of glucose is less than 1.3 mM. When the concentrations of glucose is more than 0.3 mM, several TPP+ ions extruding pumps are activated. After addition of 11 mM and higer concentrations of glucose long-term cell energization is observed. The maximal activity of efflux pumps is observed at these conditions and all TPP+ accumulated in the cells after addition of glucose is extruded back to the medium.