Lactococcus lactis ląstelių sąveikos su lizocimu tyrimai

Abstract

Lizocimas yra muramidazė, kuri plačiai paplitusi visose eukariotų rūšyse. Tai pirminis imuninės sistemos gynybos elementas kovojant su patogeninėmis mikroorganizmų rūšimis. Lizocimas pasižymi keliais antimikrobiniais aktyvumais: fermentiniu ir membraniniu, todėl su šiuo baltymu susiję mechanizmai yra plačiai tirinėjami. Fermento tyrimams yra parinktos Lactococcus lactis bakterijos, dėl savo jautrumo lizocimui, taip pat jos yra nepatogeninės, plačiai naudojamos pieno ir mėsos pramonėje. Darbo metu panaudojus potenciometrinių matavimų, HPLC, masių spektrometrijos metodus nustatyta, kad HtrA paviršinė proteazė hidrolizuoja lizocimą. Taipogi patikrinta, kad lizocimo Lys-peptidas yra pašalinamas iš inkubavimo terpės, šiame procese dalyvauja membraninė ląstelių proteazė FtsH bei oligopeptidų pernašos sistema Opp. Patvirtinta hipotezė, kad katijoninio lizocimo HLH motyvo Lys–peptido sąveika su bakterijų apvalkalu priklauso nuo ląstelių paviršiaus krūvio, kadangi peptidas saveikauja su mažiau teigiamai įkrautu ląstelių paviršiumi, kas sąlygoja galimą Lys–peptido adheziją bei dingimą iš inkubavimo terpės. Patikrinta Lys–peptido, lizocimo įtaka mutantiniams L. lactis kamienams. Patvirtinta, kad htrA mutantas yra jautresnis lizocimo, o ftsH – peptido poveikiui. Taip pat nustatyta prieš tai minėtų priedų įtaka skirtingai įkrautiems L. lactis mutantams. Šiame darbe buvo ištirta, kaip L. lactis ląstelės reaguoja į lizocimo ir Lys-peptido sukeltą atsaką į stresą. Nustatyta, kad tik laukinio tipo ląstelės turinčios LacZ geno promotorių, kuris yra aktyvinamas ląstelių atsako į minėtų priedų sukeltą stresą, geba ekspresuoti LacZ geną. Tokiu būdu žinome, ląsteles paveikus lizocimu arba Lys-peptidu šios įjungia atsako į stresą mechanizmą.

Lysozyme is the muramidase, which is highly founded in all eukaryotes. This protein is the first immune system factor fighting the pathogenic microorganisms. Lysozyme has two different activities: enzymatic and anti-membrane which is briefly studied. For these studies Lactococcus lactis cells are used. This species is nonpathogenic, sensitive to lysozyme and widely used in milk and meat industry. In this paper I used potentiometric measurements, HPLC and mass spectrometry methods, and found out that HtrA protease hydrolyze lysozyme. Also it was determined that FtsH protease and Opp system is responsible for disappearance of Lys-peptide from medium. The hypothesis about cationic Lys-peptide and bacterial cell wall interaction dependence on how positive or negative cell wall is charged was proved. Now it is known that previously noticed interaction depends on less positive charged cell wall, which causing the peptide adhesion to the cell wall. Also it was checked lysozyme’s and Lys-peptide’s impact on different L lactis MG1363 mutants. It was determined that HtrA mutant is sensitive to lysozyme, FtsH mutant – Lys-peptide. Equally were checked the sensitivity of differently charged L. lactis mutants. In this paper it was determined that lysozyme and Lys-peptide responsible for turning the cell wall stress response mechanism.