Ląstelių elektroporacija ir DNR elektropernaša į ląsteles in vitro
Kačkauskaitė, Dovilė |
Šiame darbe buvo atliekami elektrinio DNR perkėlimo mechanizmų tyrinėjimai in vitro naudojant dviejų tipų impulsus –aukštos įtampos trumpus impulsus (HV) ir žemos įtampos ilgus impulsus (LV). DNR elektropernašos eksperimentai buvo atlikti in vitro su Kinijos žiurkėno kiaušidžių CHO ląstelėmis. Eksperimentais buvo siekiama įvertinti HV ir LV impulsų svarbą DNR elektropernašos efektyvumui. Tyrimai parodė, kad DNR elektropernaša vyksta tik po ląstelių elektroporacijos. Naudojant tik LV impulsą (100 V/cm impulso stipris, 100 ms impulso trukmė), kuris ląstelių neelektroporavo, DNR elektropernaša nevyko. LV impulso svarbą DNR elektrotransfekcijos efektyvume, mes tyrėme taikydami LV impulsus 1s po HV impulsų. Kitų autorių in vivo tyrimai parodė, kad jei LV impulsas buvo taikomas po HV impulso, LV smarkiai padidino tranfekcijos efektyvumą. Priešingai nei in vivo eksperimentuose, mūsų in vitro eksperimentai tokios LV impulsų svarbos transfekcijos efektyvumui neparodė. Iš tikrųjų, nei LV impulso amplitudės padidėjimas, nei LV impulsų skaičiaus padidėjimas nepadidino DNR elektrotransfekcijos efektyvumo. Nors, naudojant įvairias HV ir LV impulsų kombinacijas elektrotransfekcijos efektyvumas nebuvo pastovus, jis nesiskyrė žymiai nuo efektyvumo, pasiekto tiktai su HV impulsu.
In this study we setup our experiments to evaluate the roles of high-voltage, short-duration (HV) and low-voltage, long duration (LV) pulses for efficient DNA electrotransfer into cells in vitro. Consistently with others and our previous in vitro and in vivo results, this study confirmed that DNA electrotransfer is possible only if cell permeabilization is achieved. Cell treatment with only one LV pulse (100 V/cm pulse strength, 100 ms pulse duration), that do not permeabilize cells had no effect for DNA electrotransfer. Contribution of LV pulse on overall DNA electrotransfer efficacy we tested by applying LV pulse 1 s following HV pulse. In previous in vivo study such type of experiments revealed that once cell is electropermeabilized, DNA electrotransfer efficacy is governed by the parameters of LV pulse. To further characterize how LV pulses facilitate DNA electrotransfer across the permeabilized membrane we setup this in vitro study. Contrary to in vivo studies, this work revealed that contribution of the LV pulses is negligible. Indeed, neither increase in LV pulse number, nor increase in LV pulse amplitude increased efficacy of DNA electrotransfer. Although, various combinations of HV and LV pulses resulted in slightly variable electrotransfer efficacy, it did not differ significantly from the efficacy achieved with only HV pulse.