Please use this identifier to cite or link to this item:https://hdl.handle.net/20.500.12259/122875
Type of publication: master thesis
Field of Science: Biologija / Biology (N010)
Author(s): Armonienė, Rita
Title: Diferencinė genų ekspresija besivystančiuose kviečių (Triticum aestivum L.) grūdvaisiuose
Other Title: Differential gene expression in developing wheat (Triticum aestivum L.) caryopses
Extent: 86 p.
Date: 3-Jun-2010
Keywords: kvietys;krakmolas;kDNR-AFLP;wheat;starch;cDNA-AFLP
Abstract: Krakmolas, kuris sudaro 65 – 75 % kviečio grūdo svorio ir gali viršyti 80 % endospermo svorio, sudaro pagrindinę paprastųjų kviečių (Triticum astivum L.) derliaus dalį. Viena iš pagrindinių kviečių krakmolo savybių yra bimodalinis krakmolo granulių dydžiui pasiskirstymas, kurį sudaro dvi A (>10 µm) ir B (<10 µm) granulių populiacijos. Krakmolo granulių dydžio pasiskirstymo, granulių morfologijos ir granulių supakavimo skirtumai tarp kviečių veislių yra lemiami krakmolo funkcionalumui, tačiau mažai yra žinoma apie genetinius šių skirtumų aspektus. Šio darbo tikslas buvo išskirti genus atsakingus už krakmolo granulių iniciaciją ankstyvoje kviečių grūdvaisių vystymosi stadijoje. Devynios žieminių kviečių genetinės linijos pasižyminčios skirtingu A granulių kiekiu buvo auginamos kontroliuojamose aplinkos sąlygose. Tolimesniam darbui buvo atrinktos dvi genetinės kviečių linijos labiausiai besiskiriančios procentiniu A granulių kiekiu (58,3 % lyginant su 47,5 % viso krakmolo kiekio). Bendroji RNR buvo išskirta iš besivystančių grūdvaisių praėjus 10 ir 15 dienų po žydėjimo. Magnetinių dalelių pagalba buvo išskirta informacinė RNR, kuri vėliau panaudota kaip matrica kDNR sintezei. Panaudojant kDNR-AFLP protokolą (Bachem et al., 1996) buvo išskirti diferenciškai ekspresuojami fragmentai, vėliau klonuoti ir nusekvenuoti. Nustatytoms sekoms buvo rastos homologijos NCBI genų banke naudojant BLASTx. Selektyviai kDNR-AFLP amplifikacijai naudota dvidešimt devynios pradmenų porų kombinacijos, kurios generavo 384 AFLP fragmentų tiriamuosiuose pavyzdžiuose, t.y. vidutiniškai 13 fragmentų kiekvienai pradmenų kombinacijai. Lyginant kviečių linijų su aukštu ir žemu A granuliu kiekiu kDNR-AFLP profilius buvo identifikuota 18 diferenciškai ekspresuojamų fragmentų. Fragmentų ilgis varijavo nuo 300 iki 1100 bp. BLAST paieška parodė, kad daugelis mūsų identifikuotų genų priklauso reguliacinių genų klasei, identifikuoti 5 nauji genai, neturintys homologiškų atitikmenų NCBI genų banko duomenų bazėje. Genų ekspresijos analizei besivystančiuose kviečių grūdvaisiuose 5, 10 ir 15 dienų po žydėjimo buvo pasirinkti šeši gerai žinomi krakmolo sintezės genai, vienas pastovia ekspresija kviečiuose pasižymintis genas ir septyni mūsų aptikti diferenciškai ekspresuojami genai. Pradmenys šiems genams buvo sukonstruoti naudojant Primer-BLAST. Analizės rezultatai parodė, kad tiek žinomų krakmolo sintezės genų, tiek mūsų aptiktų diferenciškai ekspresuojamų genų ekspesijos maksimumas pasiekiamas 10 dienų po žydėjimo. Šio darbo rezultatai ir papildomas išskirtų genų dalyvavimo krakmolo granulių sintezės kontrolėje patvirtinimas taps pagrindu kuriant DNR žymenis kviečiams su padidintu krakmolo kiekiu.
Starch, which accounts for 65 – 75 % of wheat grain weight and can exceed 80 % of the endosperm weight, is a major determinant of wheat (Triticum aestivum L.) yield. One of the key characteristics of wheat starch is the bimodal distribution of starch granule size that underlies the definition of ‘A’ (>10 µm) and “B” (<10 µm) granule populations. Differences among species in starch granule size distribution, granule morphology, and granule packing are critical to functionality of starch but little is known about the genetic basis for these differences. The aim of this work was to isolate genes responsible for starch granule initiation during early development of wheat caryopsis. Nine genetic lines of winter wheat with diverse starch A granule content were grown in a controlled environment. Two genetic lines with different A type granule content (58,3 % versus 47,5 % of total granule content) were chosen for further differential display analysis. Total RNA was extracted from developing caryopses at 10 and 15 days post-anthesis. mRNA was isolated with magnetic beads and later used as matrix for cDNA synthesis. cDNA-AFLP protocol (Bachem et al., 1996) was applied and differentially expressed fragments were isolated, cloned and sequenced. The resulting sequences were screened for homologies at NCBI gene bank using BLASTx. Twenty nine primer combinations were applied for selective amplification in cDNA-AFLP and 384 AFLP fragments generated with 13 fragments obtained per primer combination on average. Eighteen differentially expressed fragments were identified by comparing cDNA-AFLP profiles of wheat lines with high and low A granule content. The length of the fragments varied from 300 to 1100 bp. BLAST searches revealed that most of the genes identified belong to the regulatory gene class, while five novel genes with no homology to NCBI gene bank database were obtained. Six genes of starch biosynthesis, one housekeeping gene and seven differently expressed genes from our study were chosen for gene expression analysis in developing wheat caryopses at 5, 10 and 15 days post-anthesis. Primers for these genes were designed using Primer-BLAST. Analysis of the results showed that expression peak of the examined genes was achieved at early developmental stage (10 days post-anthesis) of wheat caryopses. The results of this work and further validation of isolated genes’ role in starch granule synthesis control will provide the basis for the development of DNA marker tools in wheat breeding for enhanced starch content.
Internet: https://hdl.handle.net/20.500.12259/122875
Affiliation(s): Vytauto Didžiojo universitetas
Appears in Collections:VDU, ASU ir LEU iki / until 2018

Files in This Item:
Show full item record
Export via OAI-PMH Interface in XML Formats
Export to Other Non-XML Formats


CORE Recommender

Google ScholarTM

Check


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.