Bakteriofago rb69 transkriptų skilimas veikiant Šio Fago ir e. Coli endoribonukleazėms

Abstract

Ribonukleazės vaidina svarbu vaidmenį genų ekspresijos kontrolėje keisdamos specifinių mRNR stabilumą. Ląstelės-šeimininkės RNazė E yra viena svarbiausių nukleazių, kuri dalyvauja fago T4 mRNR degradacijoje ir veikia viso infekcinio ciklo metu. Tačiau ne tik E. coli RNazės, bet ir paties fago koduojama endoribonukleazė RegB reguliuoja mRNR kiekį ląstelėje. T4 RegB yra sekai specifinė nukleazė, kuri efektyviai kerpa ankstyvąsias mRNR dažniausiai ties Šaino-Dalgarno (SD) sekos motyvo GGAG, kartais GGAU, viduriu, ir tokiu būdu išjungia ankstyvųjų mRNR transliaciją. Kai kurie RegB skelti transkriptai tampa jautrūs antriniai hidrolizei. Naujausi tyrimų duomenys parodė, kad RegB hidrolizuotas T4 mRNR antrinių kirpimų vietose skelia RNazės G ir E. T4 giminingas fagas RB69 turi geną motB, tačiau svarbios aminorūgštys skiriasi nuo T4 aminorūgščių. Šio darbo tikslas buvo išsiaiškinti ar bakteriofago RB69 tarpgeninėje srityje priešais geną motB pasireiškia pirminiai, RegB indukuoti, bei nuo RegB priklausomi antriniai skėlimai ir kuri E. coli RNazė vaidina esminį vaidmenį antrinių skėlimų procese. Darbo rezultatai parodė, kad RegB nukleazė kerpa motB geną ties GGAG motyvo viduriu. Be to, RegB skelti transkriptai tampa jautrūs antriniai hidrolizei AU turtingoje srityje iš karto už GGAG motyvo. Panaudojus izogeninius E. coli laukinio tipo bei mutantines E ir G endoribonukleazes koduojančius kamienus, nustatyta, kad antrinius taikinius RegB perskeltame fago RB69 motB transkripte kerpa E. coli koduojama RNazė G. Panaudojus plazmidės-fago sistemas mes taip pat nustatėme, kad plazmidėse koduojami fago RB69 geno motB transkriptai yra jautrūs E. coli koduojamai nukleazei G vykstant ir nevykstant faginei infekcijai. Šio darbo rezultatai parodė, kad RB69 motB geno transkripto skėlimui būtinas suderintas, fago koduojamos RegB nukleazės ir ląstelės-šeimininkės koduojamos RNazės G, aktyvumas. Rezultatai patvirtina prielaidą, kad T4 giminingi fagai turi panašias ankstyvųjų genų ekspresijos kontroles.

Ribonucleases play important role in the control of gene expression by altering the stability of specific mRNAs. Escherichia coli endoribonuclease E appears to be a major determinant of mRNA turnover throughout T4 infection, but in addition the T4 encodes its own endoribonuclease. The T4 RegB nuclease is a sequence-specific endoribonuclease, which cleaves in the middle of the GGAG motif or, in a few cases, in the GGAU, with the strong bias towards intergenic sites, and in many cases towards Shine-Dalgarno sequences. Some RegB-processed T4 transcripts were previously shown to be susceptible to further degradation at secondary sites. Recent analysis revealed that secondary cuts within RegB-processed T4 mRNAs were generated by RNases G and E. Bacteriophage RB69, the relative of T4-related phages, harbor the regB gene; however the RegB enzyme shows a substantial amino acid divergence from its T4 counterpart. The aim of this work was to identify whether the RB69 mRNA from the region upstream of gene motB undergoes the cleavage by the combined action of RegB and E. coli endoribonucleases, and to investigate the nature of secondary cuts. The results of this work show that RegB nuclease cleaves the motB transcript in the middle of GGAG motif. Moreover, RegB-cleaved mRNA is susceptible to the secondary processing within AU rich region just downstream of the GGAG. Using E. coli mutant strains deficient in RNase G and RNase E, or both of them, we show that nucleolytic events at the secondary site within RegB-processed transcript motB are generated by E. coli RNase G. Using plasmid-phage system we also demonstrate that plasmid-encoded RB69 motB transcript is susceptible to host RNase G with or without phage infection. The results of this work represent the experimental evidence that coordinated action of phage-encoded RegB together with host-coded RNase G is responsible for the cleavage of RB69 motB gene transcript. These results support the suggestion that T4-related phages have retained a similar regulation of early gene expression to that of T4.