Slyvų mikroūglių chemoterapija ir genetinis stabilumas in vitro

Abstract

Magistrantūros studijų baigiamajame darbe pateikiami duomenys apie virusų, infekavusių Magna glauca, Mlejevčenka, Čačanska včesna slyvas, eliminavimą iš slyvų genomo, panaudojant chemoterapiją antivirusiniu agentu ribavirinu in vitro. Darbe nagrinėjamas slyvų mikroūglių dauginimasis po devirusavimo ir įvertintas augalų genetinis stabilumas. Darbo objektas: Slyvų veislės: Magna glauca, Mlejevčenka, Čačanska včesna. Darbo metodai: Tyrimas atliktas 2015 – 2016 metais Lietuvos agrarinių ir miškų mokslų centro Sodininkystės ir daržininkystės instituto (LAAMC SDI), sodo augalų genetikos ir biotechnologijos skyriaus laboratorijoje (Babtai, Kauno raj.). Trijų slyvų veislių Magna glauca, Mlejevčenka ir Čačanska včesna infekuoti ACLSV ir PNRSV virusais mikroūgliai buvo įvesti į in vitro sistemą ir devirusuoti ribavirinu. Mikroūgliai 7 paras auginti ant agarizuotos maitinamosios terpės MS (Murashige and Skoog, 1962), su 6 skirtingomis ribavirino koncentracijomis (0, 10, 20, 30, 40, 50 mg l-1). Po cheminio apdorojimo, viršūninė meristema su 2-3 lapų užuomazgomis izoliuota ir auginta ant maitinamosios terpės (MS) be ribavirino, kurios pH 5,8. Eksperimentas buvo atliekamas 5 pakartojimais, kiekvienai veislei. Tris mėnesius mikroūgliai auginti ir dauginti kultivavimo kambaryje, esant 21-22°C temperatūrai ir 16/8 h fotoperiodui. Devirusuotų mikroūglių pasidauginimo koeficientas (regeneravusių slyvų mikroūglių kiekis iš 1 mikroūglio) in vitro buvo vertintas po 30, 60 ir 90 parų. Praėjus 90 parų po kultivavimo ant MS terpės, mikroūgliai buvo testuoti PGR metodu, virusinei infekcijai nustatyti ir AFLP metodu, genetiniam stabilumui įvertinti. RNR išgryninta iš homogenizuotų lapų, pagal GeneJET Plant RNA Purification mini Kit (Thermo Scientific) pridėtą protokolą. Išgryninta RNR buvo naudojama kopijinės DNR (kDNR) sintezei pagal RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit (Thermo Scientific) pridėtą protokolą. PNRSV ir ACLSV virusai buvo ieškomi naudojant specifinius pradmenis. Darbo rezultatai: Devirusuojant 7 paras slyvų ūglius MS maitinamojoje terpėje su ribavirinu mikroūgliai išliko gyvybingi. Geriausias visų tirtų slyvų veislių mikroūglių pasidauginimo koeficientas po 30 parų nustatytas variante su 20 mg l-1 ribavirino. Po 60 parų auginimo, slyvų veislėms Magna glauca ir Čačanska včesna aukščiausias pasidauginimo koeficientas (11,6 ir 6,23 vnt. iš 1 ūglio) nustatytas po devirusavimo su 10 mg l-1 ribavirino , o veislei Mlejevčenka – 20 mg l-1 ribavirino (3,5 vnt. iš 1 ūglio). Magna glauca ir Mlejevčenka slyvų mikroūglių genome ACLSV ir PNRSV virusai buvo eliminuoti po kultivavimo MS maitinamojoje terpėje su 40 mg l-1 ir 50 mg l-1 ribavirino priedu. ACLSV virusui eliminuoti iš slyvų mikroūglių reikėjo mažesnės ribavirino koncentracijos nei PNRSV virusui eliminuoti. Visiškai devirusuoti PNRSV virusu infekuotų Čačanska včesna mikroūglių, naudojant 0 – 50 mg l-1 ribavirino koncentracijas, nepavyko. Po devirusavimo skirtingomis ribavirino koncentracijomis atlikta AFLP analizė parodė, kad genetiškai stabilūs išliko Čačanska včesna veislės mikroūgliai. Magna glauca ir Mlejevčenka slyvų mikroūglių genome panaudojus ribavirino koncentracijas 40 ir 30 mg l-1 rasti pakitimai. Tai rodo nepakankamą šių slyvų veislių genetinį stabilumą. Jas devirusuoti galima tik naudojant 10 – 20 mg l-1 ribavirino koncentracijas.

The master degree thesis presents the results of virus elimination from plum microshoot genome of the infected plum species Magna glauca, Mlejevčenka, Čačanska včesna by using chemotherapy with ribavirin in vitro. Moreover, the work focuses on the microshoot propagation after chemotherapy and the assessment of the genetic stability for the investigated plum species. Object of the research: Plum species: Magna glauca, Mlejevčenka, Čačanska včesna. Research methods: The experiment of virus elimination from plums was performed in June of 2015 in the laboratory of Orchard Plant Genetics and Biotechnology in Lithuanian Research Centre for Agriculture and Forestry (LRCAF). Three plum species Magna glauca, Mlejevčenka and Čačanska včesna microshoots, which were infected by ACLSV and PNRSV viruses, were affected by chemotherapy with ribavirin with the aim to eliminate the viruses from microshoots. The microshoots of 6 variants with different ribavirin concentrations (0, 10, 20, 30, 40, 50 mg l-1) were grown on MS agar medium for 7 days (Murashige and Skoog, 1962). After 7 days of chemotherapy the microshoots were replaced on the agar medium without ribavirin. The experiment was performed in 5 replications for every plum species. Microshoots were grown and propagated in cultivation room for three months at 21 – 22 °C and 16/8 h photoperiod. Propagation coefficient of the microshoots after chemotherapy was assessed after 30, 60 and 90 days. Propagated microshoots after chemotherapy were tested for viruses by PGR method and AFLP method to assess plum genetic stability, after 90 days. Research results: It was determined that after 7 days of chemotherapy with different ribavirin concentrations on the MS culture medium, plum microshoots stayed lively. 30 days after chemotherapy the best propagation coefficient of all investigated plum species microshoots was achieved when plum were affected with ribavirin 20 mg l-1 concentration. After 60 days of cultivation, the best regenerative characteristics of Magna glauca and Čačanska Včesna plum microshoots were observed after chemotherapy with ribavirin 10 mg l-1 (11,6 and 6,23 units from 1 microshoot) and Mlejevčenka – 20 mg l-1 (3,5 units from 1 microshoot). ACLSV and PNRSV viruses were eliminated from Magna glauca and Mlejevčenka microshoots genome after chemotherapy with 40 mg l-1 and 50 mg l-1 ribavirin. ACLSV virus elimination required less ribavirin concentration than PNRSV. Full elimination of the virus PNRSV from Čačanska Včesna plum microshoots was failed using chemotherapy with ribavirin concentrations 0 – 50 mg l-1. After AFLP it was determined that Čačanska včesna microshoots remained genetically stable after chemotherapy with ribavirin concentrations 0 – 50 mg l-1. Genetic variations were identified in microshoot genome of Magna glauca and Mlejevčenka species after chemotherapy with ribavirin concentrations 40 and 30 mg l-1. That proves the sufficient genetic stability of plum and the possibility for virus elimination with 10 – 20 mg l-1 concentrations.