Sinerginis nevienalaikis elektrochemoterapijos ir genų terapijos koncepto vystymas in vitro, panaudojant ląstelių elektrinio įjautrinimo fenomeną

Nepaisant pažangos vėžio diagnostikoje ir gydyme, vėžys išlieka pagrindine visuomenės sveikatos krizę sukeliančia liga visame pasaulyje. 2020 metais visame pasaulyje buvo užregistruota daugiau nei 19 milijonų vėžio atvejų ir beveik 10 milijonų mirčių nuo vėžio, palyginti 2012-aisiais metais fiksuota 14,1 milijono naujų atvejų ir 8,2 milijono mirčių. Prognozuojama, kad iki 2070 metų kasmet bus diagnozuojama daugiau nei 34 milijonai vėžio atvejų, o mažesnes pajamas gaunančios šalys bus paveiktos dar stipriau, šiose šalyse vėžio atvejų skaičius per artimiausius 50 metų gali išaugti net 400 % [1]. Gydant organuose susidariusius navikus, viena iš didžiausių kliūčių yra vaistų pernešimas į ląsteles [2]. Šiam tikslui pritaikyta grįžtamoji elektroporacija, kuri laikinai padidina ląstelės membranos pralaidumą, naudojant trumpus, elektrinius laukus generuojančius, impulsus. Tokia procedūra padidina tam tikrų chemoterapinių vaistų patekimą į ląsteles – dėl to pavadinta elektrochemoterapija. Pavyzdžiui, įrodyta, kad dviejų chemoterapinių vaistų – bleomicino ir cisplatinos elektropernešimas į ląsteles, padidina jų citotoksinį poveikį atitinkamai 8000 ir 80 kartų. Taigi, po plataus masto vystymo, šis metodas buvo pradėtas taikyti klinikinėje praktikoje 2006 m., kai buvo įdiegta Europos elektrochemoterapijos standartinė veiklos procedūra (ESOPE) [3]. Kai kurie navikai gali plisti į epitelinius audinius ir tai įvyksta 0,7–10 % visų atvejų. Vėžinės ląstelės atsiskiria nuo pirminio naviko ir suformuoja naują piktybinį darinį kito tipo audinyje, tuo pačiu prisitaikydamos prie naujos mikroaplinkos. Manoma, kad iki 90 % mirčių nuo vėžio yra susijusios būtent su metastazavusiais navikais [1]. Viena iš taikomų metodikų odos ir poodžio vėžio metastazių gydymui yra elektrochemoterapija, tačiau įprasta elektrochemoterapija nesukelia pakankamo imuninės sistemos sužadinimo, kad būtų užkirstas kelias tolimų metastazių augimui ar naujų navikų susidarymui. Be to, didesnių nei 2 cm navikų gydymas nėra toks sėkmingas kaip mažesnių [4]. Ši terapija, tai tik laikinas ir vienkartinis odos vėžio metastazių gydymas, kurio atsakas (remisija) siekia nuo 62–99 % žuvusių vėžinių ląstelių [5]. Siekiant pagerinti elektrochemoterapijos protokolus, įrodyta, kad patobulinus įprastą elektroporaciją – vieną impulsą padalijant į kelių impulsų seką ir išlaikant pertraukas tarp jų – pasiekiamas žymiai didesnis molekulių pasisavinimas. Toks reiškinys vadinamas ląstelių įjautrinimu elektriniais laukais, kai po pradinio impulso ląstelės tampa jautresnės sekantiems. Dėl to, susidaro, pavyzdžiui, ilgiau išliekančios ir didesnio skersmens poros, kurios yra ypač reikšmingos vaistų pernašai [4]. Nepaisant šio atradimo, iki šiol trūksta pakankamai tyrimų, kurie apibrėžtų optimalų elektroporacijos protokolą, kuris ne tik žymiai padidintų elektropernašos efektyvumą, bet ir būtų lengvai pritaikomas įvairiems atvejams. Tuo tarpu norint pasiekti sisteminį elektrochemoterapijos poveikį, galima pritaikyti genų elektrotransfekciją. Jos metu, pernešama genetinė medžiaga, kuri koduoja imuninę sistemą moduliuojančias molekules [6]. Tačiau ir šiam tikslui pasiekti iškyla nemažai problemų. Norint sėkmingai atlikti genų transfekciją, ypatingai svarbu optimizuoti elektroporacijos procedūrą. Pavyzdžiui, netikslingai parinkta elektros įtampa ar impulso laikas nulemia įvairias elektrochemines reakcijas elektrodo-elektrolito ir audinio sąlyčio vietoje, kurių metu kinta terpės pH ir tai gali sukelti plazmidinės DNR denatūraciją [7]. Taigi vis dar neatradus 100 % sėkmingo gydymo nuo vėžio, yra ypatingai svarbu sudaryti optimalią, efektyvią ir saugią ląstelių įjautrinimo elektriniais laukais procedūrą. Tokia procedūra užtikrintų efekty95 vesnę vaistų bei genetinės medžiagos pernašą, kuri leistų ne tik tiesiogiai kovoti su vėžinėmis ląstelėmis, bet ir padėtų suaktyvinti organizmo sisteminį atsaką prieš navikus. Remiantis pateiktomis žiniomis apie elektroporaciją ir įvairių molekulių bei genų pernašą, išsikeltas šio tyrimo tikslas – nustatyti, kokiais parametrais galima pasiekti efektyvesnę mažų molekulių ir genų elektropernašą po CHO ir 4T1 ląstelių įjautrinimo elektros impulsais. Tikslui pasiekti, pirmiausia, įvertintas šių ląstelių gyvybingumas ir membranos pralaidumo pokytis. Tuomet, atliekant ląstelių įjautrinimą elektros impulsais, analizuota bleomicino, kalcio, plazmidinės DNR bei plazmidės-bleomicino/kalcio kombinacijos pernaša. Kiekvienas elektroporacijos eksperimentas atliktas 1-oje lentelėje nurodytomis sąlygomis, naudojant plokštelės formos, nerūdijančio plieno elektrodus, sudarant 2 mm pločio tarpą tarp elektrodų. Skirtumas tarp testuojamų grupių buvo pradinis impulsų skaičius (1 HV/8 HV) ir trukmė (1, 5, 10, 15 min) po kurios atliktas papildomas impulsas