Aneksino-A4 baltymo įtakos ląstelių plazminės membranos pažaidų atstatymui ir ląstelių gyvybingumui po elektroporacijos tyrimas

Elektroporacija (EP) tai reiškinys, kurio metu ląstelės yra veikiamos indukuotu elektriniu lauku (IEL). Veikiant IEL didėja transmembraninis potencialas, iki kol pasiekiama 0,2–1 V kritinė vertė [1], tuomet plazminėje membranoje (PM) susidaro pažaidos/poros. Dėl tokio membranos integralumo sumažėjimo padidėja laidumas elektros srovei ir įvairioms molekulėms, o dėl to šis reiškinys taip pat gali būti vadinamas elektropralaidinimu [2]. Elektropralaidinimas yra skirstoma į grįžtamą (GE) ir negrįžtamą (NGE). Toks skirstymas priklauso nuo susiformavusių porų diametro arba nuo ląstelei daromo poveikio [4]. GE įgalina molekulių patekimą į ląstelę, o NGE sukelia ląstelių žūtį [3]. Poros, kurių dydis siekia 10-9 m, geba užsiverti spontaniškai (grįžtamos), tačiau poroms, kurių dydis siekia 10-6 m (negrįžtamos), užsiverti yra reikalingi specifiniai taisymo mechanizmai [4]. Reaguodamos į membranos vientisumo pažeidimus, ląstelėse aktyvuojami įvairūs PM taisymo mechanizmus, tokie kaip yra egzocitozė, porų užkimšimas ir membranų atplėšimas (membranų sheddingas). Egzocitozės metu pūslelės, talpinančios lipidus ir pažaidų taisymui reikalingus baltymus, susilieja su FLD ir taip atstato PM vientisumą [5]. Pažeistos vietos taip pat gali būti „užkemšamos“ aneksino ir disferlino baltymais. Šie baltymai jungiasi su poros kraštais, taip palengvindami poros kraštų susiliejimą. Pažeista membranos dalis taip pat gali būti užtraukta ir atplėšta, dalyvaujant ESCRT baltymams (ang. k. Endosomal Sorting Complex Required for Transport – Su Transportu Susijęs Endosominis Rūšiavimo Compleksas) [6]. Elektroporacijos sukuriamą laikiną PM integralumo sumažėjimą galima pritaikyti medicinoje. Tyrimų kurių metu, naudojant RE, siekiama padidinti chemoterapinių vaistų efektyvumą, vadinami elektrochemoterapija (ECT) [7–8]. CET tyrimų metu 100 kartų padidintas bleomicino efektyvumas [8]. GE taip pat yra taikoma EP sukeltos genų terapijos (GET) metu, kuomet dėl elektrinio lauko poveikio į ląstelę yra įvedama egzogeninė DNR [9]. Elektroporaciją taip pat galima pritaikyti navikų ar audinių abliacijos procedūrose taikant GE [10] ir NGE [11]. Siekiant didinti medicinoje naudojamų elektroporacijos metodų saugumą ir efektyvumą yra svarbu suprasti kaip ląstelės po elektroporacijos atstato membranos integralumą. Vis dėlto dabartiniai elektroporacijos tyrimai nesuteikia pakankamai dėmesio elektropažaidų „užkimšimui“ aneksino A4 baltymu. Nors yra žinoma, kad šios superšeimos daugia funkciniai baltymai dalyvauja apoptozės (kurios metu reguliuoja PS eksternalizaciją ir Ca²+ signalų perdavimą [11]) ir nekrozės (kurios metu reguliuoja membranų taisymą ir uždegiminį atsaką [12]) metu. Siekiant padidinti Elektroporacijos metodų saugumą ir efektyvumą atliktas tyrimas, kurio metu tirta aneksino A4 svarba plazminės membranos integralumo atkūrimui ir ląstelių gyvybingumui, po poveikio elektriniais laukais. Tyrimo metu naudotos laukinio tipo MCF7-LT (LT) ir MCF7-ANXA4- (KO) ląstelės, kuriose CRISPR/Cas9 pagalba buvo išjungta aneksino A4 baltymo raiška. Siekiant įvertinti aneksino A4 pasiskirstymą ląstelėse, MCF7 (KO) ląstelės buvo transformuotos aneksino A4-GFP genu, pažymėtu GFP žyme, taip sukuriant MCF7(KO) ANXA4-GFP+ ląsteles. GFP žymėto baltymo pasiskirstymas KO-ANXA4-GFP+ ląstelėje įvertintas fluorescencinės mikroskopijos metodu. Elektropernašos efektyvumas ir porų užvėrimo dinamika įvertinti tėkmės citometrijos metodu, vertinant propidžio jodido (PI) elektroįnašą, o ląstelių gyvybingumas – MTS metodu. Tyrimo metu nustatėme, kad LT ląstelės geba išlaikyti aukštesnį gyvybingumą nei KO, nepriklausomai nuo CaCl2 priedo. Vis dėlto CaCl2 priedas neigiamai veikia ląstelių gyvybingumą kuris sumažėja nuo LT (3,2 kV/cm) ir KO (1,8 kV/cm) iki LT ( 2,2 kV/cm) ir KO (1,4 kV/cm). Tai rodo aneksino A4 svarbą membranos integralumo atkūrime. Verta paminėti, kad išmušus ANXA4 geną padidėja KO ląstelių pralaidumas PI, kuris nepriklauso nuo CaCl2 priedo, o LT ląstelių linijos laidumas PI išlieka mažesnis ir priklauso nuo CaCl2 priedo. pralaidumas PI pasiekimas ties 2,0 kV/cm EL stiprio verte, o terpėje esant CaCl2 ties 2,2 kV/cm. Po EP PM pažaidos yra sparčiai taisomos, dalyvaujant Aneksino-A4 baltymams, dėl ko galimai sumažėja LT linijos pralaidumas PI. CaCl2 priedas reikšmingai sumažina abejų linijų gebėjimą atstatyti PM integralumą. LT ląstelių po 35 minučių užveria „poras“ ties 3,6 kV/cm verte, o esant CaCl2 priedui elektrinio lauko vertė sumažėja iki 2,2 kV/cm (). Neigiamas CaCl2 priedo poveikis pastebėtas ir KO ląstelėse, kur ties 1,6 kV/cm verte PI neigiamų ląstelių skaičius sumažėja nuo iki. Gauti rezultatai patvirtina Aneksino A4 svarbą porų užvėrimo dinamikoje, kur jo svarba išryškėja esant CaCl2 priedui. Fluorescencinės mikroskopijos būdu buvo nustatyta, kad CaCl2 priedas EP terpėje stipriai pagreitina ANX A4 baltymo persiskirstymą iš citozolio link plazminės membranos. Tuo pačiu, pastebėta, kad EP terpėje esant CaCl2 ANX A4-GFP+ juda ir į branduolio apvalkalą, kai tuo tarpu, po elektroporacijos EP terpėje be kalcio šio reiškinio nebuvo pastebėta, naudojant net ir itin stiprius elektrinio lauko (e.l.) impulsus. ANX A4-GFP+ baltymo persiskirstymo greitis ir intensyvumas iš citozolio į plazminę membraną stipriai koreliavo su e.l. stipriu ir jam didėjant, greitėjo ir intensyvėjo ANX A4-GFP+ aktyvumas. Šio tyrimo metu pademonstravome Aneksino A4 ir CaCl2 svarbą plazminės membranos integralumo atkūrimui ir ląstelių gyvybingumo palaikymui. Aneksino A4 baltymas mažina NGE ir GE procedūrų efektyvumą, bet jis yra gyvybiškai svarbus PM integralumo atkūrimui. Vis dėlto siekiant padidinti ląstelių mirtingumą (NGE) gali būti naudojamas CaCl2 priedas.