Biochemijos katedra / Department of Biochemistry

Šiuolaikinėse biotechnologijose ieškoma pažangių ir tvarių metodų, leidžiančių kryptingai modifikuoti augalų fiziologinius procesus ir vertingų metabolitų biosintezę. Viena iš perspektyvių technologijų yra neterminė plazma (NTP), kurios poveikis siejamas su aktyviųjų deguonies ir azoto formų, jonizuotų ir neutralių dalelių bei UV spinduliuotės sąveika. Šio darbo tikslas – įvertinti trumpalaikio Stevia rebaudiana sėklų apdorojimo NTP poveikį daigumui, augalų agronominėms savybėms ir metabolitų biosintezei, bei nustatyti fiziologinius ir biocheminius augalų atsakus. Nustatyta, kad NTP poveikis S. rebaudiana yra kompleksinis ir priklauso nuo plazmos tipo, kultivaro, apdorojimo trukmės bei auginimo sąlygų. Kondensatoriaus tipo plazma efektyviausiai skatino steviolio glikozidų biosintezę. Kiekio padidėjimas nustatytas kultivaro 'Criolla' ir vegetatyviai padaugintiems lietuviško kultivaro augaluose. Ankstyvose augimo stadijose bendras kiekis padidėjo iki 2 kartų, o vėlesnėse – reikšmingo stimuliuojančio poveikio nenustatyta, todėl atsakas siejamas ir su augalo vystymosi faze. Kultivarų atsakas į NTP buvo nevienodas – Shug augaluose buvo skatinama antrinių metabolitų biosintezė, o Hybrid – stimuliuojamas sėklų daigumas, ypač po apdorojimo dielektrinio barjero iškrovos plazma. Rezultatai atskleidžia NTP potencialą kaip kryptingą biostimuliacijos priemonę metabolizmui modifikuoti, tačiau būtina atkreipti dėmesį į poveikio parametrų parinkimą ir kompleksinio augalų atsako vertinimo svarbą.

Šiame darbe nagrinėjamas multimodalinio vaizdinimo ir mašininio mokymo taikymas veterinarinių gyvūnų odos navikų diagnostikai. Darbo aktualumas grindžiamas tuo, kad histologinė analizė, nors ir yra auksinis standartas, priklauso nuo specialisto patirties ir vertinimo, todėl negalima išvengti žmogiškų klaidų. Tyrime analizuojami trijų tipų vaizdinimo duomenys: šviesaus lauko, fluorescencinis ir ultragarsinis vaizdinimai. Naudojant pastaruosius vaizdus buvo apskaičiuoti skaitmeniniai tekstūriniai požymiai, kurie naudoti klasifikuojant gyvūnų (kačių ir šunų) odos vėžį, mastocitomą ir minkštųjų audinių sarkomą. Klasifikacijai taikyta tiesinė diskriminantinė analizė, atraminių vektorių mašina ir atsitiktinių miškų modeliai. Gauti rezultatai parodė, kad vienmodalinis vaizdinimas yra ribotas diferencijuojant piktybinius navikus tarpusavyje, tuo tarpu multimodalinis vaizdinimas ženkliai pagerina klasifikavimo efektyvumą. Geriausi rezultatai pasiekti naudojant atraminių vektorių mašiną, kur ploto po klasifikatoriaus veikimo charakteristikos kreivės vertė siekė apie 0,95. Tai rodo, kad skirtingų vaizdinimo tipų kombinacija leidžia gauti papildomą informacinę vertę ir pagerinti navikų diferenciaciją.

Šių laikų žemės ūkio tendencijos skatina ieškoti efektyvių ir modernių tręšimo būdų. Nanodalelių (ND) purškimas ant augalų lapų yra vienas iš tokių būdų. Tyrimo tikslas ištirti ZnO ND dydžio ir koncentracijos poveikį lapinio kopūsto (Brassica oleracea L.) antioksidacinės sistemos atsakui, Zn kaupimuisi augale ir augimo parametrams. Tyrimas buvo atliktas kontroliuojamos aplinkos augalų auginimo kameroje hidroponinėje sistemoje. Buvo ištirti trys ZnO ND dydžiai (18, 35-45 ir 80-200nm) ir trys koncentracijos (200, 400 ir 800ppm). Zeta potencialo matavimai parodė, kad 35-45nm ZnO ND suspensija buvo stabiliausia -32mV ir iki 66% dalelių išliko nanodydžio. 35-45nm dydžio ir 800ppm ZnO ND suspensija lapų masę padidino 60%, o šaknų 39% lyginant su kontrole. Nustatytas antioksidacinio aktyvumo padidėjimas naudojant 35-45nm 200ppm koncentracijos ZnO ND suspensiją. Didžiausias Zn kaupimasis buvo nustatytas panaudojus 35-45nm dydžio ir 800ppm koncentracijos suspensiją. Apibendrinus rezultatus galime teigti, kad ZnO ND fizikocheminės savybės turi įtaką augalų augimui, antioksidaciniam atsakui ir Zn kaupimuisi augale.

Tyrimo problema: Infekcijos, atsirandančios dėl implantų įstatymo į žmogaus organizmą, dažniausiai sukeliamos Staphylococcus aureus bakterijų. Šios bakterijos kolonizuojasi ant implanto paviršiaus ir suformuoja bioplėveles, taip mažindamos implanto tarnavimo laiką ir sukelia pavojų žmogaus sveikatai. Titano lydiniai yra plačiai naudojami implantų gamyboje, bet titano lydiniai padengti skirtingomis medžiagomis gali turėti skirtingą poveikį bakterijų gyvybingumui bei bioplėvelės formavimuisi. Tyrimo klausimas: kokį poveikį titano lydiniai turi S.aureus bakterijų gyvybingumui ir bioplėvelės formavimuisi? Tyrimo objektas: titano lydinių sąveika su laukinio S.aureus tipo bakterijomis ir klinikiniais S.aureus izoliatais. Tyrimo tikslas: ištirti titano lydinių poveikį Staphylococcus aureus gyvybingumui ir bioplėvelės formavimuisi. Tyrimo metodika ir metodai: Tyrimo metu buvo paruoštos bakterijų suspensijos, kurios buvo naudojamos tam, kad įvertinti titano lydinių antibakterinį aktyvumą apskaičiuojant CFU vertes. Tyrime buvo įvertintas kiekvieno iš titano lydinių diskų hidrofobiškumas, matuojant vilgymo kampas. Bioplėvelės įvertinimui buvo atliktas kristalo violeto dažymo būdas. Duomenims apdoroti ir juos pateikti buvo naudojama statistinė analizė. Rezultatai: Ti-6Al-4V lydinių diskai pasižymėjo antibakteriniu aktyvumu ir slopino S.aureus bakterijų bioplėvelės formavimąsi. Diskai, padengti hidroksiapatitu su papildomomis medžiagomis, turi didesnį slopinamąjį poveikį bakterijų gyvybingumui. Išvados: Ti-6Al-4V lydinių diskai padengti su hidroksiapatitu ir papildomomis medžiagomis turi didesnį antibakterinį poveikį. Didžiausią slopinamąjį poveikį bioplėvelės formavimusi turėjo Ti-6Al-4V ir to pačio lydinio, kurio paviršius nitridintas diskai. Šios išvados leidžia daryti prielaidą, kad juos galima naudoti implantų gamyboje tam, kad būtų sumažinta infekcijų rizika ir S.aureus bakterijų kolonizacija ant jų paviršių.

Tyrimo problema: gramneigiamų bakterijų atsparumas antibiotikams tampa vis didesne problema šiuolaikinėje medicinoje. Bakterijų išorinė membrana veikia kaip apsauginis barjeras, ribojantis įvairių medžiagų patekimą į ląstelę. Impulsinių elektrinių laukų (PEF) technologija gali padidinti membranos pralaidumą sukeldama elektroporaciją, todėl svarbu įvertinti bakterijų membranų elektrinių savybių pokyčius po PEF poveikio. Elektrocheminė admitanso spektroskopija suteikia galimybę realiuoju laiku stebėti membranų laidumo pokyčius ir įvertinti bakterijų būklę. Tyrimo klausimas: kaip skirtingo stiprumo impulsiniai elektriniai laukai veikia Escherichia coli bakterijų membranų pralaidumą ir metabolinį aktyvumą? Tyrimo objektas: Escherichia coli DH5α gramneigiamos bakterijos. Tyrimo tikslas: įvertinti impulsinių elektrinių laukų poveikį E. coli bakterijų membranų pralaidumui ir metaboliniam aktyvumui, taikant elektrocheminę admitanso spektroskopiją. Tyrimo metodika ir metodai: tyrime naudotos Escherichia coli DH5α bakterijos, augintos LB terpėje 37 °C temperatūroje. Bakterijų elektrinių savybių pokyčiai buvo vertinami naudojant elektrocheminę admitanso spektroskopiją, taikant 1 V sinusinį signalą 100 kHz–1 MHz dažnių diapazone. Elektroporacija atlikta naudojant impulsinių elektrinių laukų generatorių, taikant 2–24 kV/cm stiprumo impulsus. Admitanso pokyčiai registruoti prieš ir po centrifugavimo. Bakterijų metabolinis aktyvumas vertintas naudojant alamarBlue fluorescencinį metodą. Duomenų analizė atlikta naudojant „Microsoft Excel 2024“ ir „GraphPad Prism 8“ programas. Rezultatai: nustatyta, kad didėjant elektrinio lauko stipriui didėjo ir E. coli suspensijos admitansas. Esant 2–6 kV/cm buvo stebima grįžtamoji elektroporacija ir išliekantis metabolinis aktyvumas, o ≥10 kV/cm laukuose fiksuotas ryškus admitanso padidėjimas bei metabolinio aktyvumo sumažėjimas. Po centrifugavimo admitansas sumažėjo mažesnio stiprio laukų mėginiuose, tačiau išliko padidėjęs esant ≥12 kV/cm, rodydamas ilgalaikius membranų pažeidimus. Didžiausiuose elektrinio lauko stipriuose metabolinis aktyvumas praktiškai išnyko, o tai rodo galimą negrįžtamą elektroporaciją ir bakterijų lizę.

Tyrimo problema: Nanodalelės pasižymi dvejopu poveikiu. Patekusios į aplinką, ypač į dirvožemį, jos gali trikdyti ekosistemų pusiausvyrą, mažinti dirvožemyje gyvenančių ir svarbias biologines funkcijas atliekančių bakterijų gyvybingumą. Kita vertus, nanodalelės plačiai tiriamos dėl jų potencialo medicinoje, ypač kaip antibakterinės medžiagos. Vis dėlto metalų nanodalelės gali sukelti nepageidaujamą poveikį ir žinduolių ląstelėms. Chitozanas – antibakterinėmis savybėmis pasižymintis biopolimeras, galintis modifikuoti nanodalelių antibakterinį poveikį. Todėl svarbu ištirti chitozano įtaką geležies(III) oksido nanodalelėms, siekiant įvertinti jų antibakterinį poveikį bakterijoms. Tyrimo klausimas: Kokį poveikį turi vidutinės ir mažos molekulinės masės chitozanas geležies(III) oksido nanodalelių antibakteriniam poveikiui prieš gram- teigiamasias bakterijas? Tyrimo objektas: Geležies(III) oksido nanodalelių, dengtų vidutinės ir mažos molekulinės masės chitozanu antibakterinis poveikis Bacilus subtilis ir Staphylococcus aureus bakterijoms. Tyrimo tikslas: Nustatyti vidutinės ir mažos molekulinės masės chitozano įtaką geležies(III) oksido nanodalelių poveikiui gram-teigiamosioms bakterijoms. Tyrimo metodologija: Siekiant įvertinti chitozano įtaką geležies(III) oksido nanodalelių antibakteriniam poveikiui, buvo atlikti antibakteriniai tyrimai naudojant geležies(III) oksido nanodaleles bei vidutinės ir mažos molekulinės masės chitozaną. Antibakterinis poveikis buvo nustatomas vertinant KFV. Taip pat buvo tirti chitozanu dengti geležies(III) oksido nanodalelių mėginiai.Gauti rezultatai buvo palyginti taikant statistinę analizę. Buvo vertinamas ir reaktyviųjų deguonies formų (ROS) generavimo intensyvymas matuojant fluorescencijos intensyvumą. Rezultatai: Gauti rezultatai rodo, kad geležies(III) oksido nanodalelių ir chitozano antibakterinis poveikis priklauso nuo koncentracijos. Taip pat nustatyta, kad geležies(III) oksido nanodalelės, dengtos vidutinės ir mažos molekulinės masės chitozanu pasižymi stipresniu antibakteriniu poveikiu prieš Bacilus subtilis ir Staphylococcus aureus. Išvados: Geležies(III) oksido nanodalelės, dengtos mažos molekulinės masės chitozanu pasižymi statistiškai reikšmingu antibakteriniu poveikiu B. subtilis bakterijoms. S.aureus bakterijose sugeneruojamas didžiausias kiekis ROS, paveikus bakterijas geležies oksido nanodalelėmis, dengtomis vidutinės ir mažos molekulinės masės chitozanu. B. subtilis daugiausia ROS susidaro paveikus bakterijas geležies oksido nanodalelėmis, dengtomis mažos molekulinės masės chitozanu.

Šiuolaikinėje biotechnologijoje vis didesnę reikšmę įgauna fiziniai sėklų aktyvinimo būdai, ypač neterminės (šaltosios) plazmos technologija, pasižyminti reaktyviųjų deguonies ir azoto formų gausa bei žema temperatūra, todėl tinkama biologinių sistemų apdorojimui. Saldžioji stevija (Stevia rebaudiana Bertoni) yra vertingas natūralus saldiklis, plačiai naudojamas maisto ir farmacijos pramonėje, todėl aktualu ieškoti būdų, galinčių pagerinti jos augimo ir biocheminius rodiklius. Šiame darbe buvo tiriamas šaltosios plazmos, elektromagnetinio lauko ir plazma aktyvinto vandens poveikis aeroponinėje sistemoje augintos stevijos morfometriniams ir biocheminiams parametrams. Vertintas šių veiksnių poveikis sėklų daigumui, augalų morfometriniams rodikliams, fotosintezės pigmentų bei steviolio glikozidų kiekiui. Gauti rezultatai parodė, kad elektromagnetinis laukas turėjo didžiausią teigiamą poveikį stevijos sėklų daigumui, o dielektrinio barjero iškrovos plazmos poveikis buvo silpnesnis. Taikyti fiziniai veiksniai reikšmingai veikė augalų morfometrinius rodiklius, fotosintezės parametrų ir steviolio glikozidų kiekį. Didžiausias glikozidų kiekis nustatytas taikant kondensatoriaus tipo plazmos apdorojimą 5 min., o skirtingi apdorojimo režimai keitė rebaudiozido A ir steviozido santykį, svarbų saldiklių kokybei.

Pasaulyje per metus pagaminama 120 mlrd. litrų etanolio, iš kurių beveik 80 proc. sunaudojama skystajam kurui. Tačiau pagrindinės etanolio gamybos žaliavos yra krakmolas ir sacharozė, kurios kartu yra svarbios maisto produktų, ir gyvulių pašarų sudedamosios dalys, kas sukelia didelę etinę problemą. (Gong ir kt., 2022). Dėl to ieškoma alternatyvių šaltinių, kurie galėtų sėkmingai pakeisti sacharozę ir krakmolą, o kartu būtų nemaistiniai pakaitai, todėl pagrindinė alternatyva yra sausa augalų biomasė – lignoceliuliozė (Abo ir kt., 2019). Bioetanolio gamyba iš lignoceliuliozės monosacharidų – gliukozės, ksilozės ir disacharido - celiobiozės, kuri yra atsinaujinanti ir nebrangi žaliava, yra labai svarbi ekologiniu ir ekonominiu požiūriu. Šiuos cukrus natūraliai gali fermentuoti termotolerantiškos metilotrofinės mielės O. polymorpha – kurių maksimali augimo temperatūra 50°C, todėl tai gali būti patogus organizmas pramoninei etanolio gamybai. Pagrindinis šio darbo tikslas: įvertinti elektrocheminiais matavimais skirtingai auginamų O. polymorpha mielių ląstelių ksilozės ir gliukozės sukeliamą įtaką kvėpavimo bei glikolizės procesams. Tyrimo metu nustatyta, kad O. polymorpha modifikuotų padermių metabolizmo intensyvumas skiriasi priklausomai nuo naudojamo sacharido – gliukozės ar ksilozės ir auginimo sąlygų. Visų tirtų O. polymorpha mielių padermių ląstelės reagavo net į mažas gliukozės koncentracijas stipriu ištirpusio deguonies įsisavinimu ir ekstraląsteliniu rūgštėjimu. Tačiau reakcija į ksilozės priedą buvo žymiai silpnesnė, ypač jeigu pirma buvo pridėta gliukozė. Tuo yra patvirtinama, kad tarp ksilozės ir gliukozės vyksta konkurentinis slopinimas. Taip pat nustatyta, kad padidėjusi inkubavimo temperatūra labiau pagreitina ląstelių kvėpavimą nei glikolizę.

COVID-19 pandemija parodė, kad tradiciniai metodai, tokie kaip PGR, turi technologinių ribojimų siekiant greitai ir tiksliai diagnozuoti virusų sukeltas ligas. Atsižvelgiant į vis dažniau pasitaikančias virusų sukeliamas ligas ir visuomenės poreikį greitiems bei tiksliems virusinių ligų diagnostikos tyrimams, vis daugiau dėmesio skiriama izoterminės amplifikacijos metodams. Ypač aktualūs tampa amplifikacijos metodai, tokie kaip grandinės išstūmimo amplifikacija (SDA) bei eksponentinė amplifikacijos reakcija (EXPAR), kurie amplifikacijai vykdyti naudoja nikazes – fermentus, įkerpančius vieną DNR grandinėje dvigrandėje DNR. Dėl šios priežasties yra svarbu sukurti šių fermentų ekspresijos ir gryninimo sistemas, kadangi didesnis nikazių prieinamumas atveria galimybes plačiau naudoti SDA ir EXPAR technologijas medicinoje. Darbo metu sėkmingai sukonstruota tiriamąją DNR nikazę ekspresuojanti plazmidė. Parinktas optimaliausias E. coli ekspresijos kamienas, optimizuota nikazės, turinčios histidino inkarą, gryninimo sistema. Išgrynintas baltymas išbandytas SDA reakcijose, nustatyta baltymo koncentracija ir specifinis aktyvumas.

Tyrimo metu tirta CHO ląstelių transfekcija, taikant nanosekundinės trukmės impulsų (nsEP) ir sinusoidinės bangos formos elektroporacijos (sinEP) protokolus. Taip pat tyrimo metu įvertinome transfekcijos efektyvumo priklausomybę nuo prieš procedūrinės 10 minučių inkubacijos 0-4 °C temperatūroje. Ląstelės transfekuotos pEGFP-N1. Transfekcijos efektyvumas įvertintas tekmės citometrijos metodu, vertinant GFP baltymo ekspresiją. Taip pat įvertintas transfekuotų ląstelių skaičius, fluorescencijos pokyčiai ir atkeltų ląstelių skaičius. Ląstelių metabolinis aktyvumas įvertinas PMS/MTS metodu. Tyrimo metu nustatyta, kad prieš nanosekundinės trukmės elektroporaciją ląsteles paveikus sinusinės bangos elektroporacija, transfekuotų ląstelių skaičius gali išaugti 15 %. Vis dėl to šių stebėjimų nepavyko pakartoti, ląsteles prieš procedūrą inkubuojant 10 min. 4 °C temperatūroje. Dėl to atrodo, kad sinEP sukuriamas poveikis yra minamalus, tirtame diapazone (10 kHz; 100 V/cm; 1 min), o transfekcijos ir transgeno ekspresijos efektyvumui yra reikšmingesni tokie veiksniai kaip ląstelių augimo fazė ir temperatūra. Šiuos stebėjimus patvirtina ir tai, kad ląstelių nepavyksta transfekuoti taikant tik sinEP, tirtame parametrų diapazone. Vis dėlto nsEP metodą pavyko patobulinti padidinant transfekcijos efektyvumą (TE) nuo 12,5 % iki 40 %. Tyrimo metu pademnstravome, kad taikant tik nsEP ir ląsteles prieš procedūra inkubuojant ledų vonelėje, bei palaikant ląstelių konfluenciją iki 40 % galima pasiekti 40 % TE, 1,5×106 vidutinę transfekuotos ląstelės fluoresceniją (eTE), tuo pačiu išlaikant metabolį 90% aktyvumą.