DNR elektropernašos į ląsteles in vitro efektyvumo priklausomybė nuo laiko tarpo tarp aukštos ir žemos amplitudės elektrinių impulsų
Maziukienė, Aurelija |
Šio tiriamojo darbo tikslas – naudojant aukštos amplitudės, trumpus (HV) ir žemos amplitudės, ilgus (LV) elektrinius impulsus, įvertinti DNR elektropernašos į Kinijos žiurkėno kiaušidžių (CHO) ląsteles in vitro efektyvumo priklausomybę nuo laiko tarpo tarp 1HV ir 1LV impulsų. Vykdant DNR elektropernašą elektropernašos į Kinijos žiurkėno kiaušidžių (CHO) ląsteles, buvo stengiamasi išskirti dvi elektrinio lauko poveikio funkcijas: membranų elektroporacijos, kurią sukelia aukštos įtampos, mažos trukmės (HV) elektrinis impulsas, ir DNR elektroforezės, kuri priklauso nuo žemos įtampos, ilgos trukmės (LV) impulso parametrų. Iškėlėme hipotezę, kad HV impulso poveikyje susiformavusios ląstelės membranos poros impulsui pasibaigus iškart ima mažėti, todėl tikimės, kad sumažinę laiko tarpą tarp 1HV ir 1LV impulsų, pasieksime didesnio DNR transfekcijos efektyvumo. Tyrimuose buvo naudojamos žalią fluorescencinį baltymą ir liuciferazę koduojančios plazmidės, kurių koncentracijos – 10, 50 ir 100 µg/ml. Pasirinkti tokie impulsų parametrai: 1HV – 1200 V/cm, 100 µs, 1LV – 100 V/cm, 100 ms. Pasirinktos laiko trukmės tarp 1HV ir 1LV impulsų – 1 µs, 10 µs, 100 µs, 1ms, 10 ms, 100 ms ir 1 s. Nustatėme, kad naudojant trumpesnius nei 1s laiko trukmės tarpus tarp 1HV ir 1LV elektrinių impulsų, didėja suminis DNR elektropernašos į CHO ląsteles efektyvumas bei transfekuotų ląstelių dalis, kuri apskaičiuojama nuo kiekvienoje eksperimentinėje grupėje išlikusių gyvybingų ląstelių, tačiau mažėja CHO ląstelių gyvybingumas. Naudojant skirtingas plazmidinės DNR koncentracijas nustatėme, kad didėjant DNR koncentracijai didėja pernešamos į CHO ląsteles DNR kiekis bei elektropernašos efektyvumas.
The aim of this experimetal study was to evaluate dependence of DNA electrotransfer into Chinese hamster ovary cells in vitro on time gap between high amplitude, short duration (HV) and low amplitude, long duration (LV) electric pulses. We investigated the effectiveness of DNA electrotransfer into Chinese Hamster Ovary cells in vitro using two types of pulses and aimed to dissociate cell electroporation, induced by HV pulses, and DNA electrophoresis dependence on the parameters of LV pulses. Our hypothesis was based on the notion that soon after HV pulse pores are formed in cell membrane start to shrink. We expected to reach better efficiency of DNA electrotransfer by reducing time gap between 1HV and 1LV electric pulses. We used three GFP and luciferase encoding plasmids concentrations – 10, 50 and 100 µg/ml. The parameters of pulses were: HV – 1200 V/cm, 100 µs, LV – 100 V/cm, 100 ms. Time gap duration between pulses were – 1 µs, 10 µs, 100 µs, 1 ms, 10 ms, 100 ms and 1 s. Our results confirmed that DNA electrotransfer through a permeabilized membrane is dependent on time gap between short duration, high voltage (HV) and long duration, low voltage (LV) electric pulses and plasmid DNA concentration. We found that using shorter than 1 s duration of time gap between 1HV and 1LV pulses results in decrease in cell viability, but also results in increases of total DNA transfection efficiency and percentage of transfected cells that were counted from viable cells in each experimental group. When we used larger concentration of plasmid DNA, we obtained higher transfection efficiency that allows to presume that larger amount of DNA was transferred into CHO cells.