Please use this identifier to cite or link to this item:https://hdl.handle.net/20.500.12259/85807
Type of publication: master thesis
Field of Science: Biologija / Biology (N010)
Author(s): Adomaitis, Marius
Supervisor: Paulauskas, Algimantas
Title: E.coli BGX:rh-GCSF darbinio ląstelių banko stabilumo analizė
Other Title: Stability testing of working cell bank of E. coli BGX3:rh – GCSF
Extent: 58 p.
Date: 22-May-2019
Keywords: E.coli;E.coli;Ląstelių bankai;Cell banks;Granuliocitų kolonijas stimuliuojantis faktorius;Granulocyte colony-stimulating factor
Abstract: 2019 m. UAB „Sicor Biotech“ Biosintezės linijoje buvo tiriamas E.coli BGX:rh-GCSF darbinio ląstelių banko stabilumas ir tinkamumas granuliocitus stimuliuojančio baltymo (G-CSF) sintezei. Tam buvo sukurtas naujas protokolas pagal gerą gamybos praktiką (GGP) sintetinti baltymą kolboje, kad būtų išvengta didelės skalės fermentacijos. Testuojamas ląstelių bankas buvo laikomas skysto azoto garų fazėje –140°C temperatūroje. Kaip šaldomoji terpė pridėtas glicerolis, kuris sudarė 30% (v/v). G-CSF baltymas sintetintas kolboje, E.coli ląstelių pagalba. Banko tinkamumui tikrinti atlikta E.coli BGX:rh-GCSF plazmidės stabilumo, kopijų kiekio, kolonijų skaičiaus analizė ir SDSPAGE elektroforezė. Baltymo sintezė baigėsi E.coli biomasei pasiekus 2,35 optinius vienetus, naudojant 600nm bangos ilgį. Gautas 100% E.coli BGX:rh-GCSF plazmidės stabilumas, o gyvų bakterijų skaičius siekė - 2,6 × 109 kolonijas sudarančių vienetų (KSV) mililitre. SDS-PAGE elektroforezė taip pat parodė kad bakterijos sėkmingai sintetino G-CSF baltymą. Plazmidės kopijų skaičius, kuris buvo tirtas kiekybiniu PGR metodu, vidutiniškai siekė 245 kopijas kiekvienoje ląstelėje. Visų analizių rezultatai atitiko reikalavimus ir specifikuojamas ribas. Kultūros švarumas tikrintas naudojant plataus spektro mikrobų augimui skirtą triptono sojų agaro (TSA) terpę. Gauta kultūra buvo švari, atitinko visas standartines E.coli kultūros savybes. Ant neužsėtos neigiamos kontrolės lėkštelės augimo nebuvo. Be to, visos darytos analizės atitiko keliamus kokybės kontrolės standartų reikalavimus. Galima teigti, kad ląstelių bankas laikomas tinkamomis sąlygomis, o ląstelės neprarado savo genetinio stabilumo, gyvybingumo, ir yra tinkamos naudoti baltymo sintezėje.
The stability of E.coli BGX:rh-GCSF working cell bank and it‘s suitability for the synthesis of granulocyte colony stimulating protein (G-CSF) were tested in the biosynthesis line of plant “Sicor Biotech“. For this purpose, a new protocol for the synthesis of protein in a flask was created to avoid large-scale fermentation, according to Good Manufacturing practice (GMP). Tested cell bank was stored in liquid nitrogen vapor phase at -140°C temperature. Glycerol was added as a refrigerant medium, which was 30% (v/v). The G-CSF protein was synthesized in a flask from E.coli cells as a host. E.coli BGX:rh-GCSF plasmid stability, copy number, colony count and SDS-PAGE electrophoresis were performed to verify cell bank suitability. Protein synthesis ended with E.coli biomass reaching 2.35 optical units using 600 nm wavelength. Stability of 100% E.coli BGX:rh-GCSF was obtained and live bacterial count reached 2,6 × 109 colony forming units (CFU). SDS-PAGE electrophoresis also showed that the bacteria successfully synthesized the G-CSF protein. The number of copies of the plasmid was determined by quantitative PCR method and resulted in average of 245 copies per cell. The results of all methods matched the requirements and specified ranges. Culture purity was tested using wide spectrum microbial growth Tryptic Soy Agar (TSA) medium. Grown culture was pure and met all standard E.coli culture characteristics. In addition, there was no growth on the negative control plate and all methods met quality control requirements. According to the data received, cell bank is held in proper conditions and the cells have not lost their genetic stability, viability and are suitable for usage in protein synthesis.
Internet: https://hdl.handle.net/20.500.12259/85807
Appears in Collections:2019 m. (GMF mag.)

Files in This Item:
marius_adomaitis_md.pdf4.14 MBAdobe PDF   Until 2024-05-22View/Open
Show full item record
Export via OAI-PMH Interface in XML Formats
Export to Other Non-XML Formats


CORE Recommender

Page view(s)

90
checked on Sep 6, 2020

Download(s)

22
checked on Sep 6, 2020

Google ScholarTM

Check


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.