| Abstract: | Dygliavaisis virkštenis (Echinocystis lobata (Michx.) Torr. & A. Gray) Lietuvoje ir daugelyje pasaulio vietų – pripažintas invazine rūšimi ir laikoma viena iš daugelio pavojingiausių Europoje. Gali būti auginamas kaip dekoratyvinis augalas, dėl savo žiedų ir spygliuotų, dekoratyviai atrodančių vaisių. Dygliavaisis virkštenis – žolinis, vienametis augalas, dažniausiai augantis drėgnose upių, ežerų ir kitų vandens telkinių pakrantėse.
Darbo tikslas buvo atlikti molekulinių žymenų paiešką Lietuvos paupių dygliavaisio virkštenio (Echinocystis lobata) populiacijų molekulinės įvairovės vertinimui.
Populiacijų paieška ir individų rinkimas tyrimams vyko 2015–2016 metais. Iš viso Lietuvoje rastos 35 dygliavaisio virkštenio populiacijos. Iš visų populiacijų tyrimams buvo surinkti 342 individai.
Dygliavaisio virkštenio DNR išskyrimui buvo išbandyti trys metodai: CTAB metodas, universalus genominės DNR išskyrimo rinkinys „Genomic DNA purification kit“ K0512, papildomai DNR priemaišas valant sorbitoliu ar kolonėlėmis (OneStep™ PCR Inhibitor Removal Kit). Išbandžius skirtingus DNR išskyrimo metodus buvo parinktas tinkamiausias Echinocystis lobata DNR išskyrimo būdas – naudojant gamyklinį DNR išskyrimo rinkinį „Genomic DNA purification kit“ K0512 (Thermo Scientific, Lietuva). Pagal naudotą skirtingą augalo sausosios masės (s. m.) kiekį, įvertinta išskirtos DNR koncentracija ir jos grynumas. Atrinktu metodu dygliavaisio virkštenio DNR išskirta iš visų 35 tiriamų populiacijų rastų prie įvairių Lietuvos upių.
Pirmiausiai buvo bandoma pritaikyti mikrosatelitų (PKS) pradmenis. Tam buvo pasirinktos artimiausių dygliavaisiam virkšteniui Cucurbitaceae šeimos augalų tyrimams naudotos 29 mikrosatelitų pradmenų poros. Pradmenų poros (N1, N6, N12, S9, S13, S15, S26) buvo sukurtos ir panaudotos raukšlėtojo svaidenio (Momordica charantia) tyrimuose, pritaikius reakcijos sąlygas ir pradmenų prikibimo temperatūras iš šių porų tiko 6. Kitos 22 poros buvo paprastojo agurko (Cucumis sativus) ir atlikus šių pradmenų pritaikymo bandymus, teigiamus rezultatus davė 11 pradmenų porų (SSR05723, SSR23220, SSR23370, SSR05012, SSR07543, SSR19998, SSR16068, SSR31399, SSR20218, SSR29620, SSR11340).
Remiantis užsienio literatūra apie Cucurbitaceae šeimos augalų tyrimus, pagausintų fragmentų ilgio polimorfizmams tirti buvo išbandytos 8 PFIP pradmenų poros. Visos jos davė teigiamus rezultatus, todėl jų pagalba išanalizuota 6 populiacijų, iš trijų šalių, dygliavaisio virkštenio genetinė įvairovė. Su visomis 8 pradmenų poromis buvo gauti polimorfiniai lokusai. Bendras visų populiacijų polimorfizmas lygus 47,82 %. Didžiausias Šenono informacijos indeksas buvo Lapių (0,363) populiacijoje. Ši populiacija pasižymėjo ir kraštutinėmis Nei genetinės įvairovės vertėmis, atitinkamai 0,253 ir 0,120. Genetiniai atstumai tarp E. lobata populiacijų kito nuo 0,126 iki 0,265. Genetinės įvairovės procentas tarp populiacijų buvo daug mažesnis (9,22 %), nei populiacijų viduje (90,78 %). Įvertinta genetinė įvairovė gana maža, ФPT = 0,092. Bajeso tikimybių analizės duomenimis tirtos dygliavaisio virkštenio populiacijos sudaro tris klasterius.
Remiantis užsienyje atliktais sekoskaitos tyrimais buvo išbandytos 15 pradmenų porų taikant skirtingas PGR reakcijos programas, pritaikant pradmens prikibimo temperatūrą kiekvienai pradmenų porai. Pabandžius pritaikyti Lietuvos dygliavaisio virkštenio populiacijoms šias pradmenų poras su 7 poromis gauti teigiami rezultatai, todėl šios pradmenų poros naudojamos tolimesniems sekoskaitos tyrimams.
Wild cucumber – herbal, annual plant, usually growing in moist rivers, lakes and other coast. It is native in North America. It can be grown as an ornamental plant for its flowers and spiny, ornamental fruits. Wild cucumber (Echinocystis lobata) in Lithuania and in other parts of the Europe is recognized as invasive species and considered to be one of the most dangerous according to the spread along continent.
The objective of present study was to search for molecular markers for evaluation of genetic diversity of wild cucumber (Echinocystis lobata (Michx.) Torr. & A. Gray) in Lithuanian populations.
Populations and individuals search and collection for the studies took place in 2015–2016. At total 35 wild cucumber populations were found in Lithuania. Total number of 342 individuals out of all populations was collected.
Wild cucumber DNA extraction was performed following three methods: CTAB method, universal genomic DNA extraction kit “Genomic DNA purification kit, K0512”, additional DNA contaminant cleaning with sorbitol or columns (OneStep™ PCR Inhibitor Removal Kit) also was done. Comparison of DNA quantities and quality revealed that among tested different DNA extraction methods, the best Echinocystis lobata DNA extraction method was to apply “Genomic DNA purification kit K0512“ (Thermo Scientific, Lithuania) and follow protocol suggested by company. Extracted DNA concentration and purity was tested with the purpose to select the most favourable dry mass (d. m.) of the plant. DNA extraction was applied for individuals of 35 populations of wild cucumber collected in various riverbank places near various Lithuanian rivers.
Firstly, selection and adaptation of the microsatellite (SSR) primers was tested. For this purpose, 29 microsatellite primer pairs were chosen based on the usage for closest plants in Cucurbitaceae family. The primers pairs (N1, N6, N12, S9, S13, S15, S26) were created and used in the studies of Momordica charantia. The best conditions of polymerase chain reaction were determined and 6 pairs showed positive results. The other 22 pairs were selected of Cucumis sativus and after applying best PCR conditions 11 primer pairs (SSR05723, SSR23220, SSR23370, SSR05012, SSR07543, SSR19998, SSR16068, SSR31399, SSR20218, SSR29620, SSR11340) gave positive results.
Based on foreign literature on Cucurbitaceae family plant studies, eight AFLP primer pairs were tested. Polymorphic loci have been obtained with all 8 primer pairs. The genetic diversity of 6 populations from three countries was analysed. The mean polymorphism of all populations is 47.8 %. The largest index of the Shannon information was in Lapės (0.363) population. This population was also marked by extreme Nei genetic diversity values of 0.253 and 0.120. Genetic distances between E. lobata populations ranged from 0.126 to 0.265. Percentage of genetic diversity among populations was much smaller (9.22 %) compared to inside of populations (90.78 %). Genetic diversity is relatively low, ФPT = 0,092. According to the Bayesian cluster analysis populations have three clusters.
Based on sequencing studies carried out in foreign countries, 15 primer pairs were tested using different PCR reaction programs, adjusting annealing temperature for each primer pair. 7 pairs generated positive results and these primer pairs are used for further sequencing studies. |
