Characterization of recombinant CRISPR-Cas associated DinG helicase activities

Abstract

Helicases are proteins that are capable of unwinding annealed nucleic acid strands found e.g. in double stranded DNA or RNA molecules. The damage inducible helicase G (DinG) was initially identified as a part of the bacterial SOS response. Computational analyses revealed dinG genes to be located in close proximity to CRISPR arrays of the bacterial CRISPR–Cas immune system. Its frequent association and close proximity with CRISPR-Cas systems suggests a still unknown involvement in CRISPR-Cas immunity. Previous biochemical characterization of recombinant DinG from S. putrefaciens established a investigated the helicase activity on dsDNA substrates varying lengths, but no activity could be observed. In this thesis, it was investigated if DinG is functionally associated to the interference process of the Type I-Fv CRISPR- Cas system.

Helikazės sutinkamos visuose gyvuose organizmuose Žemėje, bei dalyvauja tokiuose svarbiuose ląstelės procesuose kaip transkripcija, rekombinacija, transliacija ir kt. Jos priklauso baltymams galintiems išpinti nukleininių rūgščių (DNR ir RNR) dvigubas grandines. Žalą sukelianti helikase G (dinG) iš pradžių buvo identifikuojama kaip bakterinės SOS sistemos dalis ir vėliau ji buvo klasifikuojama kaip XPD baltymų šeimos narys. XPD baltymų šeimos būdingas bruožas yra konservatyvus ATP hidrolizuojantis domenas, kuris užtikrina efektyvų nukleino rūgčių išpynimą. Naujausi tyrimai parodė, kad dinG genas yra artimai susijęs su CRISPR masyvu, tuo pačiu ir su CRISPR-Cas sistema. CRISPR-CAS yra adaptyvi imuninė sistema, kuri aptinkama archėjose ir daugumoje bakterijų. Į ląstelę patekęs įsibrovėlis (fagas arba plazmidė) yra atpažįstamas ir jo DNR fragmentas, naujo skirtuko pavidalu, yra įstatomas į CRISPR regioną, kuris yra nurašomas į ilgą pirminę CRISPR RNR (crRNR) molekulę, kuri kartotinių sekose yra sukarpoma iki mažų crRNR molekulių. Subrendusios crRNR molekulės su Cas baltymais jungiasi į ribonukleobaltyminį (RNB) kompleksą, kuris aptinka ir sunaikina svetimą nukleorūgštį, jei ši turi komplementarią crRNR seką, vadinamą proskirtuku.