Pavienių molekulių fluorescencinės mikroskopijos DNR restriktazių sąveikos su DNR tyrimai

Restrikcijos endonukleazės (REazės) yra fermentai, kurių funkcija yra atpažinti specifinę DNR seką – taikinį (5’-ACTGGG-3’) - ir ją perkirpti. Jos yra bene vienas svarbiausių įrankių, naudojamų genų inžinerijoje. Šie fermentai yra nepakeičiami, kai reikia atlikti DNR fragmentų manipuliacijas - sekos iškirpimą ar perkirpimą (Goodsell D. S., 2002). Šiame darbe analizuojamos II – ojo tipo REazės: laukinio tipo (WT) BfiI, „susiūtas“ (S-S) BfiI mutantas, aktyvaus centro BfiI K107A mutantas ir „susiūtas“ (S-S) aktyvaus centro BfiI K107A mutantas. BfiI fermentai, išskiriami iš Bacillus firmus S8120 štamo, yra priskiriami IIS potipio REazėms ir fosfolipazių D superšeimai. BfiI REazės skiriasi nuo kitų IIS tipo restriktazių tuo, kad, skirtingai nuo daugelio REazių, DNR karpoma nesant Mg2+, bet šis kofaktorius pagreitina karpymą dėl numanomų konformacinių pokyčių. BfiI REazė kerpa DNR viršutinę grandinę už 5, o apatinę – už 4 nukleotidų nuo atpažinimo sekos (Šapranauskas R., 2008). BfiI pasiekia maksimalų aktyvumą tik tuomet, kai sąveikauja su dviem atpažinimo sekomis. BfiI turi vieną aktyvųjį centrą, kurį sudaro du N-terminalinio domeno subvienetai (Sasnauskas G. ir kt., 2003). Šio baigiamojo darbo tikslas – ištirti BfiI Reazių sąveiką su DNR panaudojant PMFRET mikroskopijos metodą. Tikslo įgyvendinimui buvo iškelti šie uždaviniai: ištirti DNR - baltymų sąveikos dinamiką pavienių molekulių (PM) lygyje; įvertinti BfiI mutacijų įtaką dinaminės sąveikos kinetikoms; charakterizuoti aptiktas FRET efektyvumo būsenas; atlikti PMFRET mikroskopijos duomenų analizę ir grafinę rezultatų reprezentaciją. Šiame darbe FRET pora žymėtos biotinilintos DNR molekulės buvo imobilizuotos ant silanizuoto ir PEGilizuoto (10% biotin-PEG) stiklo paviršiaus per neutravidiną (nAv). Ypatingai stipri ir ilgai trunkanti biotino – nAv sąveika užtikrina, kad imobilizuoti DNR fragmentai neatsijungtų nuo paviršiaus, ir todėl ši sistema gali būti naudojama net iki kelių valandų. Kai abu BfiI REazės monomerai prisijungia po DNR taikinį, susiformuoja DNR kilpa, o to pasekoje donoras ir akceptorius atsiduria greta. Sužadintas donoras perduoda energiją šalia esančiam akceptoriui, ir vyksta akceptorinio fluoroforo fluorescencija. Dvigrandė DNR žymėta 3' gale fluoroforu Cy3 arba Cy3B (donoras), kitame 5' gale – fluoroforu Atto647N (akceptorius). Susiformavus kilpai atstumas tarp FRET poros tampa ~5 nm, todėl FRET efektyvumas padidėja. Nesant baltymui daugiausiai registruojamas žemas FRET efektyvumas, nes DNR yra visada nekilpota, ir atstumas tarp FRET porų yra ~ 300 nm. REazės indukuotas DNR kilpojimasis analizuojamas panaudojant PMFRET metodą. Vaizdai buvo užregistruoti naudojant TIRF mikroskopiją, kaitaliojant lazerio žadinimą (ALEX) ir nekaitaliojant lazerio žadinimo (žadinant vienu lazeriu). Gust A. ir kt., (2014) teigia, kad pritaikant TIRF mikroskopijos metodą galima: tuo pačiu laiko momentu analizuoti šimtus individualių molekulių, stebėti nesinchronizuotus arba retus molekulių pokyčius, analizuoti akceptoriumi ir donoru žymėtas molekules kaitaliojant lazerio žadinimą. D. Rutkauskas ir kt. (2014) moksliniais tyrimais įrodė, kad susidarius sąveikai tarp baltymo ir dviejų DNR taikinių, esančių ant vieno DNR fragmento, yra indukuojamas kilpos formavimasis. Šiuose eksperimentuose ir buvo stebimas toks DNR kilpojimas. Kadangi BfiI REazės taikinys nėra palindrominis, fiziškai gali susidaryti tik vienos formos kilpa. DNR kilpos susidarymas yra dažnai pasitaikantis reiškinys įvairiuose biocheminiuose DNR ir baltymo sąveikos procesuose, pavyzdžiui, reguliuojant genų ekspresiją, DNR replikacijoje ir rekombinacijoje. Šiame darbe tiriami sąveikos su DNR mechanizmai analizuojant skirtingas BfiI REazes ir jų koncentracijas, keičiant reakcijos sąlygas ir Mg2+ jonų koncentraciją, panaudojant PMFRET mikroskopiją. Tyrimai šioje srityje svarbūs tuo, kad baltymų - DNR sąveika atlieka svarbų vaidmenį biologinėse sistemose, ir šios sąveikos dažnai apima sudėtingus mechanizmus ir nehomogenišką dinamiką. Taip pat šie tyrimai svarbūs REazių biotechnologijai.
Mūsų tyrimai atskleidė, kad BfiI-K107A-SS aktyvaus centro mutacija (K107A) padidina baltymo konformacinę dinamiką. Su BfiI-K107A-SS baltymu pastebima daugiau aukštesnio FRET efektyvumo būsenų negu su BfiI-SS. Mg2+ jonai reakcijos mišinyje ir K107A mutacijos įvedimas padidina tikimybę perėjimams tarp aukštesnių FRET efektyvumo būsenų, o tai gali būti susiję su baltymo konformacine dinamika. Mg2+ jonai taip pat turi įtakos stebimų būsenų trukmei – jas prailgina.

Restriction enzymes recognize specific nucleotide sequences in a double stranded DNA and cleave both strands of the duplex. In vivo REases protect their host bacteria from viral attacks by cleaving foreign DNA. In vitro, they are widely used as a molecular tool for various DNA manipulations (D. Rutkauskas et al., 2014). Restrictase BfiI belongs to the phospholipase D (PLD) superfamily and does not require metal ions for DNA cleavage. It recognizes an asymmetric DNA sequence, 5’-ACTGGG-3’, and cuts top and bottom strands at fixed positions downstream of this sequence (G. Sasnauskas et al., 2003). Here we are studying several versions of BfiI REase: WT BfiI, BfiI-SS, BfiI-K107A, BfiI-K107A-SS. The wild-type BfiI is a native protein. In BfiI-SS protein SS bridge is linking the dimer interface (M. Zaremba et al., 2015). In BfiI-K107A protein mutation was introduced in the active center at residue 107 - Lysine was changed to Alanine. BfiI-K107A-SS protein contains both mentioned mutations. In this research we have studied interaction between DNA and BfiI restriction enzymes using single – molecule Forster Resonance Energy Transfer (smFRET) total internal reflection (TIR) microscopy. Biotinylated DNA molecules bearing two targets for BfiI and FRET pair dyes close to these targets were immobilized on a silanized and PEGylated (metoxy-PEG and biotin PEG mixture) glass surface via neutravidin. The protein induces formation of DNA loop: one BfiI site binds one target and second another, and therefore brings the FRET pair in close proximity. The aim of the research is to investigate the interactions of BfiI REases with DNA using the smFRET microscopy method. The goals of the research are: to study the dynamics of DNA - protein interactions at the single molecule level; to evaluate influence of BfiI mutations for interaction kinetics and dynamics; to characterize detected FRET efficiency states; to carry out the smFRET microscopy data analysis and graphical representation of results. Our acquired smFRET signals have shown multiple FRET level lasting for several seconds. We observed that FRET efficiency and duration was affected by BfiI mutation, cross-linking and Mg2+ ions/ion strength.