Plyšinių jungčių sudarytų iš 36 koneksino laidumo reguliavimo mechanizmo tyrimas.

Abstract

Magistro darbo tikslas - ištirti n-alkoholių ir bendrųjų anestetikų stimuliuojančio poveikio Cx36 plyšinių jungčių laidumui mechanizmą. Uždaviniai: 1. Atlikti heksanolio, nonanolio ir izoflurano jungimosi vietų prie Cx36 ir kitų Cx struktūrinį modeliavimą; 2. Nustatyti heksanolio, nonanolio ir izoflurano poveikį Cx36 laukinio tipo ir mutantų plyšinių jungčių laidumui. Trumpos anglies grandinės n-alkoholiai (iki oktanolio) ir bendrieji anestetikai (izofliuranas) stimuliuoja plyšinių jungčių, sudarytų iš Cx36, laidumą. Tačiau plyšinių jungčių sudarytų iš kitų tipų Cx, laidumą, n-alkoholiai slopina nepriklausomai nuo anglies grandinės ilgio. Atlikus struktūrinį heksanolio ir nonanolio jungimosi prie Cx36 modeliavimą, nustatyta unikali heksanolio prisijungimo vieta Cx36 kišenėje, esančioje 4-e transmembraniniame domene (TM4), bei pastebėta C264, esančio TM4, ir C92, esančio gretimo Cx36 subvieneto TM2 domene, lokalizacija atstumu, leidžiančiu formuotis disulfidiniams tilteliams tarp Cx36 subvienetų. Atlikome C264S ir C92V vienetines ir dvigubą mutacijas bei atlikę šių mutantų trumpalaikę transfekciją N2A ir HeLa ląstelėse, dvigubo „patch-clamp“ metodu ištyrėme heksanolio, nonanolio ir izofliurano poveikį plyšinių jungčių, sudarytų iš šių mutantų, laidumui. Tyrimo išvada - disulfidinių tiltelių formavimasis tarp C264 ir C92 gretimuose Cx36 subvienetuose slopina Cx36 PJ laidumą, o stimuliuojantis heksanolio ir izoflurano poveikis galimai pasireiškia dėl konformacijos, nutolinančios C264 ir C92 ir nebeleidžiančios formuotis disulfidiniams tilteliams tarp jų.

The aim of this study was to investigate the mechanism of the stimulatory effect of n-alcohols and general anesthetics on Cx36 gap junction conduction. The objectives were as follows: 1. To perform a structural modeling of the docking sites of hexanol, nonanol and isoflurane with Cx36 and other Cxs. 2. To examine the effects of hexanol, nonanol and isoflurane on conductance of gap junctions formed of WT and mutant Cx36. Short carbon chain n-alcohols (up to octanol) and general anesthetics stimulate the conductance of Cx36 gap junction channels in contrast to other types of Cxs that all are inhibited by n-alcohols independent on carbon chain length. We performed a structural modeling of Cx36 protein docking with hexanol and nonanol and identified multiple common docking sites, and a single pocket accessible only to hexanol. The pocket is located in the vicinity of two unique cysteine residues, C264 in the fourth and C92 in the second transmembrane domain of the neighboring Cx36 subunits. To examine the hypothesis that inter-subunit disulphide bonding might be involved in the stimulatory effect of hexanol, we generated single and double cysteine substitution/s in Cx36 and demonstrated by dual whole-cell patch-clamp technique that these mutations reversed the stimulatory effect of hexanol and isoflurane to inhibitory one, typical to other Cxs that lack respective cysteines and specific docking pocket for these compounds. Conclusion – the stimulatory effect of hexanol and isoflurane may be achieved by preventing the formation of inter-subunit disuphide bonds that maintain the Cx36 gap junction channels in pre-inhibited state.