Please use this identifier to cite or link to this item:https://hdl.handle.net/20.500.12259/34825
Type of publication: Magistro darbas / Master thesis
Field of Science: Biologija / Biology
Author(s): Galinytė, Violeta
Title: Propidžio jodido elektropernašos priklausomybė nuo monosluoksnyje esančių ląstelių formos
Other Title: PI electrotransfer dependence on the shape of the cell in monolayer
Extent: 45 p.
Date: 24-May-2017
Event: Vytauto Didžiojo universitetas. Gamtos mokslų fakultetas. Biologijos katedra
Keywords: Elektroporacija;Propidžio jodidas;Elektropernaša;Monosluoksnis;Electroporation;Propidium iodide;Electrotransfer;Monolayer
Abstract: Vienas iš dažniausiai naudojamų metodų genų ir vaistų pernešimui į ląsteles yra elektroporacija. Paveikus elektriniais laukais, ląstelių transmembraninis potencialas yra padidinamas. Jeigu transmembraninis potencialas pasiekia kritinę ribą (maždaug 0,4 -0,9 V), ląstelės membranos pralaidumas įvairioms molekulėms laikinai yra didesnis. Manoma, kad ląstelių membranos pralaidumo padidėjimas, yra indukuojamų hidrofilinių porų membranoje rezultatas. Po to, kai indukuojamos poros ląstelės membranoje, įvairios hidrofilinės molekulės (priešvėžiniai vaistai, plazmidinė DNR, siRNA ir t.t.) difuzijos ir/arba elektroforezės būdu migruoja per hidrofilines poras membranoje. Šis procesas yra vadinamas elektropernaša. Kadangi nėra galimybės vizualizuoti elektroporų, vienintelis būdas analizuoti elektroporacijos reiškinį – naudojant molekulių elektropernašą. Vienos iš dažniausiai šiuose tyrimuose naudojamų molekulių yra propidžio jodidas (PI). Šiame darbe naudojant PI elektropernašos modelį buvo ištirta molekulių elektropernašos priklausomybė nuo ląstelių formos. Elektropernašos monosluoksnyje tyrimams buvo naudojama kininio žiurkėnuko kiaušidžių (CHO) ląstelių linija. Elektroporacija buvo atliekama su vienu arba dviem (720 V/cm, 950 V/cm arba 1400 V/cm, 100 μs trukmės) impulsais. Tarpas tarp impulsų 1 s. Naudota 40 μg/ml PI koncentracija. Ląstelių elektroporacija buvo atliekama elektroporacijos terpėje (pH 7.1, laidumas 0.1 S/m, osmosinis slėgis 270 mOsm). Elektrodai buvo patalpinti po fluorescenciniu mikroskopu ir visas elektropernašos procesas vaizdintas fluorescencinėje šviesoje, pradedant: 3 sekundėms prieš elektroporaciją, elektroporacijos metu ir 80 s po elektroporacijos kas sekundę. Gauti vaizdai buvo tvarkomi su atviros prieigos programa ImageJ. Taip gauta PI fluorescencijos dinamika ląstelėje. Kiekviename eksperimento taške buvo analizuojama 50 ląstelių. Analizuojant ląstelių monosluoksnį ląstelės buvo suskirstytos į dvi formas (ištęstos ir suplotos) priklausomai nuo padėties elektrodų atžvilgiu. Visi eksperimentų duomenys parodė 3 tendenciją, kad suplotų ląstelių PI elektropernaša yra didesnė, lyginant su ištęstų ląstelių. Tačiau statistinis patikimumas keitėsi taikant skirtingo intensyvumo elektrinius laukus. Lyginant suplotas ir ištęstas ląsteles buvo gauta stipri skirtingos PI elektropernašos reikšmė (p <0,001) praėjus 10 s po to, kai buvo taikytas 720 V/cm impulsas. Kai buvo taikomas 950 V/cm impulsas reikšmingas skirtumas buvo pastebėtas po 60 s, o su 1400 V/cm buvo pastebėtas nereikšmingas skirtumas tarp ištęstų ir suplotų ląstelių. Šiame darbe parodėme, kad ląstelės forma turi didelę įtaką PI elektropernašai į ląstelę. Manome, kad tai priklauso nuo skirtingai sukelto transmembraninio potencialo, priklausančio nuo ląstelės formos. Darbe taip pat parodyta, kad ląstelių formos įtaka PI elektropernašoje mažėja, kad sugeneruojamas didesnis transmembraninis potencialas.
One of the most frequently used method for gene and drug delivery to the cells is electroporation. Cell transmembrane potential is increased when effected with electrical fields. If transmembrane potential reaches threshold (around 0.4 – 0.9 V) cell membrane temporal permeability to various molecules is increased. It is believed that cell membrane permeability increases as a result of induced hydrophilic pores on membrane. After induction of the pores on the membrane, various hydrophilic molecules (anticancer drugs, plasmid DNA, siRNA and etc.) diffuse and/or electrophoretically migrate through the hydrophilic pores in the membrane. This process is termed molecule electrotransfer. As there is no possibility to visualize electropores, the only way to study electroporation phenomenon is by using molecule electrotransfer measurements. One of the most frequently used molecule for these studies is propidium iodide (PI). Once inside the cell PI intercalate to genetic material of the cell, resulting in significantly increased quantum efficiency of PI fluorescence. PI electrotransfer model to investigate the dependency of cell shape on electroporation. Chinese hamster ovary (CHO) cell line was used as an object for PIelectrotransfer in monolayer. Electroporation was performed with one (720 V/cm, 950 V/cm or 1400 V/cm at duration of 100 μs) pulse. Used PI concentration was 40 μg/ml. Cell electroporation was performed in electroporation medium (pH 7.1, conductivity 0.1 S/m, osmolarity 270 mOsm). Electrodes were placed under the inverted fluorescent microscope and all the electrotransfer process was imaged under fluorescent light starting from 3 seconds before electroporation, during electroporation and 80 s after electroporation every second. Taken images were processed with open access software ImageJ. PI fluorescence dynamics within the cell was obtained. At least 50 cells at each experiment point was analyzed. Cells were divided into two shapes (prolate and oblate) while analyzing cell monolayer. All experiment data showed tendency that PI electrotransfer is higher in prolate cells compared to 5 oblate cells. However the significance changed when applying different intensity electric fields.10 s after applying 720 V/cm pulse a strong significance (p<0.001) of different PI electrotransfer has been obtained comparing oblate and prolate cells. When 950 V/cm pulse was applied the significant difference was seen only after 60 s and with 1400 V/cm no significant difference was observed between prolate and oblate cells. We showed that cell shape has major impact to PI electrotransfer to the cell when induced transmembrane potential is at the electroporation threshold levels. We also showed that higher transmembrane potential reduces cell shape impact to PI electrotransfer.
Internet: https://eltalpykla.vdu.lt/1/34825
https://hdl.handle.net/20.500.12259/34825
Appears in Collections:2017 m. (GMF mag.)

Files in This Item:
violeta_galinyte_md.pdf1.16 MBAdobe PDF   Restricted AccessView/Open   Request a copy

Show full item record

Page view(s)

76
checked on Oct 13, 2019

Google ScholarTM

Check


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.