Optimizuotos struktūros rekombinantinių fibronektino III tipo 9 ir 10 domenų gamyba bakterinėje raiškos sistemoje

Abstract

Šių laikų polimerų nanoinžinierijos ir regeneracinės medicinos mokslo atstovai turi bendrą aktualų tikslą – kurti apibrėžtos molekulinės struktūros ir sudėties polimerinius paviršius bei hidrogelius, į kurių sudėtį įeitų sintetiniai ar rekombinantiniai peptidai, kurie in vitro galėtų imituoti natūralios organizmo ekstraląstelinės terpės (ECM) sąvybes, o in vivo – suteiktų pažeistoms ar naujai integruojamoms ląstelėms gyvybingumo ir funkcionalumo. Fibronektinas (FN) yra vienas svarbiausių žmogaus ECM baltymų, kartu su kitais ECM balymais atliekantis ląstelių adhezijos, proliferacijos, specializacijos, pažaidų reparacijos ir specifinio atsako funkcijas biologine ir biochemine prasme. Už kiekvieną iš šių funkcijų yra atsakingas ne visas baltymas, o specifiniai jo domenai, turintys atitinkamus funkcinius motyvus. FN III tipo 10 domenas turi aminorūgščių RGD motyvą, kuris atsakingas už ląstelių adheziją ir genų raiškos reguliavimą sąveikaudamas su ląstelių membranose esančiais receptoriais integrinais, o FN III tipo 9 domenas turi sinerginį aminorūgščių PHSRN motyvą, kuris sąveikaudamas su integrinais sustiprina RGD motyvo adhezinę funkciją iki 100 kartų, pats vienas beveik neįtakodamas jos. Šiuo darbu buvo paruoštos fibronektino III tipo 9 ir 10 domenų rekombinantinės DNR ir pTXB1 vektoriaus konstrukcijos, kurias klonavus Escherichia coli BL21(DE3) raiškos sistemoje, panaudojus bakteriofago T7 promotoriaus genų raiškos reguliavimo sistemą su IPTG induktoriumi, buvo susintetinti rekombinantiniai baltymai ir išgryninti, panaudojant inteino žymei specifišką chitino afininės chromatografijos metodą. Įvertintas gautų baltymų grynumas ir išeiga. Modern polymer nanotechnology and regenerative medicine scientists have a common goal – to develop polymeric surfaces and hydrogels of defined molecular structure and composition, containing synthetic or recombinant peptides that could mimic the extracellular matrix (ECM) properties of a natural organism in vitro, and in vivo could give viability and functionality to damaged or newly integrated cells. Fibronectin (FN) is one of the most important human ECM proteins, performing, together with other ECM proteins, the functions of cell adhesion, proliferation, specialization, lesion repair, and specific response in biological and biochemical terms. Not a whole protein is responsible for each of these functions, but rather it‘s specific domains with corresponding functional motifs. FN type III domain 10 has an amino acid RGD motif that is responsible for cell adhesion and regulation of gene expression by interacting with integrins on cell membranes, and FN type III domain 9 has a synergistic amino acid PHSRN motif that interacts with integrins to enhance the cell adhesion up to 100 fold, alone almost unaffecting it. During this research recombinant DNA of fibronectin type III 9 and 10 domains and pTXB1 vector constructs were prepared, and by cloning them in the Escherichia coli BL21(DE3) expression system, using a bacteriophage T7 promoter gene control system with an IPTG inducer, recombinant proteins have been synthesized and purified using label specific chitin affinity chromatography method. The purity and yield of the obtained proteins were evaluated