Vienalaikės pernašos dviem skirtingomis plazmidėmis įtaka jų elektropernašos efektyvumui
Vaškys, Dovydas |
Elektroporacija yra svarbus genų pernašos metodas taikomas biotechnologijoje ir medicinoje. Vis dažniau reikalinga vienalaikė kelių plazmidžių pernaša (kotransfekcija), tačiau plazmidžių tarpusavio sąveikos ir konkurencija dėl ląstelės resursų gali neigiamai veikti proceso efektyvumą ir rezultatus. Šio darbo aktualumą lemia poreikis geriau suprasti šiuos reiškinius optimizuojant kotransfekcijos protokolus. Darbo tikslas – nustatyti, kaip vienalaikė dviejų skirtingų plazmidžių (pEGFP-N1 ir mCardinal) elektropernaša į CHO ląsteles veikia kiekvienos plazmidės pernašos efektyvumą, ekspresijos lygį ir ląstelių gyvybingumą, bei įvertinti paties elektroporacijos proceso ir egzogeninės DNR įtaką ląstelių išgyvenamumui. Tyrimas atliktas naudojant CHO-K1 ląstelių liniją ir dvi plazmides: pEGFP-N1 (4,7 kb) bei mCardinal (6,2 kb). Ląstelės transfekuotos elektroporacijos būdu, taikant skirtingus stačiakampių impulsų parametrus, naudojant kiekvieną plazmidę atskirai arba abi kartu. Kontrolinei analizei ląstelės elektroporuotos be plazmidžių. Transfekcijos efektyvumas, ir genų raiška (pagal fluorescencijos intensyvumą) vertinti taikant tėkmės citometriją, o ląstelių gyvybingumas matuotas MTS/PMS metodu. Tyrimo metu nustatytas asimetriškas plazmidžių poveikis viena kitai: mCardinal slopino pEGFP-N1 pernašą ir raišką, o pEGFP-N1 didino mCardinal pernašos efektyvumą, bet mažino jos raišką ir ląstelių gyvybingumą. Abiem kotransfekcijos atvejais stebėtas sumažėjęs genų raiškos lygis, lyginant su pavienių plazmidžių transfekcija, kas rodo reikšmingą konkurenciją dėl ląstelės resursų. Taip pat nustatyta, kad pEGFP-N1 plazmidė pasižymėjo didesniu citotoksiškumu nei mCardinal. Patvirtinta, kad pagrindinį neigiamą poveikį ląstelių gyvybingumui daro ne patys elektros impulsai (naudotame diapazone), o jų derinys su egzogenine DNR.
Electroporation is an important gene transfer method applied in biotechnology and medicine. Simultaneous delivery of multiple plasmids (co-transfection) is increasingly relevant, but plasmid interactions and competition for cellular resources can negatively affect process efficiency. The aim of this work is to better understand these phenomena for optimizing co-transfection protocols. The aim of this study was to determine how simultaneous electrotransfer of two different plasmids (pEGFP-N1 and mCardinal) into CHO cells affects the transfer efficiency and expression level of each plasmid, cell viability, as well as to evaluate the influence of the electroporation process itself and exogenous DNA on cell survival. The study was performed using the CHO-K1 cell line and two plasmids: pEGFP-N1 (4.7 kb) and mCardinal (6.2 kb). Cells were transfected by electroporation using different square-wave pulse parameters, applying each plasmid individually or both together. For control analysis, cells were electroporated without plasmids. Transfection efficiency and gene expression (based on fluorescence intensity) were assessed using flow cytometry, while cell viability was measured by the MTS/PMS method. The study revealed an asymmetric effect of the plasmids on each other: mCardinal inhibited pEGFP-N1 transfer and expression, while pEGFP-N1 increased mCardinal transfer efficiency but reduced its expression and cell viability. In both co-transfection cases, a decreased gene expression level was observed compared to single plasmid transfection, indicating significant competition for cellular resources. It was also determined that the pEGFP-N1 plasmid exhibited higher cytotoxicity than mCardinal. It was confirmed that the main negative impact on cell viability is caused not by the electric pulses themselves (within the used range) but by their combination with exogenous DNA.