DNR nikazės ekspresijos sistemos kūrimas ir optimizavimas
Sakavičius, Haroldas |
COVID-19 pandemija parodė, kad tradiciniai metodai, tokie kaip PGR, turi technologinių ribojimų siekiant greitai ir tiksliai diagnozuoti virusų sukeltas ligas. Atsižvelgiant į vis dažniau pasitaikančias virusų sukeliamas ligas ir visuomenės poreikį greitiems bei tiksliems virusinių ligų diagnostikos tyrimams, vis daugiau dėmesio skiriama izoterminės amplifikacijos metodams. Ypač aktualūs tampa amplifikacijos metodai, tokie kaip grandinės išstūmimo amplifikacija (SDA) bei eksponentinė amplifikacijos reakcija (EXPAR), kurie amplifikacijai vykdyti naudoja nikazes – fermentus, įkerpančius vieną DNR grandinėje dvigrandėje DNR. Dėl šios priežasties yra svarbu sukurti šių fermentų ekspresijos ir gryninimo sistemas, kadangi didesnis nikazių prieinamumas atveria galimybes plačiau naudoti SDA ir EXPAR technologijas medicinoje. Darbo metu sėkmingai sukonstruota tiriamąją DNR nikazę ekspresuojanti plazmidė. Parinktas optimaliausias E. coli ekspresijos kamienas, optimizuota nikazės, turinčios histidino inkarą, gryninimo sistema. Išgrynintas baltymas išbandytas SDA reakcijose, nustatyta baltymo koncentracija ir specifinis aktyvumas.
The COVID-19 pandemic highlighted the technological limitations of traditional methods such as PCR in rapidly and accurately diagnosing virus-induced diseases. In light of the increasing prevalence of viral infections and the growing public demand for fast and reliable diagnostic tests, greater attention is being directed towards isothermal amplification methods. Particularly relevant are amplification techniques such as Strand Displacement Amplification (SDA) and Exponential Amplification Reaction (EXPAR), which utilise nicking enzymes – enzymes that introduce single-stranded breaks in double-stranded DNA – to facilitate amplification. Consequently, it is essential to develop effective systems for the expression and purification of these enzymes, as increased availability of nicking enzymes enables broader application of SDA and EXPAR technologies in medical diagnostics. In this study, a plasmid expressing the target DNA nicking enzyme was successfully constructed. The optimal E. coli expression strain was selected, and an optimised purification system for the histidine-tagged nicking enzyme was established. The purified protein was tested in SDA reactions, and both the protein concentration and specific activity were determined.