Rekombinantinio fibronektino III tipo 9-10 domeno peptido gamyba tabako augaluose
Tabako augalas yra plačiai naudojamas kaip augalinės ekspresijos sistema gaminant antikūnus, farmacinius ir pramoninius baltymus. Rekombinantinių baltymų gamyba uždaroje sistemoje (in vitro) yra ekonomiškai efektyvi ir kokybiška alternatyva tradiciniams metodams. Šio tyrimo tikslas buvo sukurti uždaro tipo paprastojo tabako augalų (Nicotiana tabacum) audinių auginimo sistemą rekombinantinio peptido, atkartojančio fibronektino III tipo 9-10 domeno segmentus (FN9-10), gamybai. Buvo sukurta DNR konstrukcija, pagrįsta pDGB3_alpha1 plazmidės vektoriumi, su pastoviu p35S promotoriumi ir t35S terminatoriumi, kurią taip pat sudarė žaliai fluorescuojančio baltymo (avGFP) žymuo, naudojamas rekombinantinio baltymo ekspresijos analizei, polihistidino (6xHis) žymė baltymų afininiam gryninimui ir „WELQut“ proteazės kirpimo vieta tikslinio peptido atskyrimui. Tabako lapo audiniai buvo transformuoti naudojant Agrobacterium tumefaciens. Tabako transformantų atranka buvo atlikta naudojant skirtingas antibiotikų koncentracijas ir avGFP žymens fluorescenciją. Naudojant avGFP fluorescencijos ir fluoresceino diacetato pagrindu pagrįstą ląstelių metabolinio aktyvumo testą buvo įvertinta rekombinantinio peptido konstrukcijos ekspresija skirtingose transformuotų ląstelių suspensijos linijose. Atlikus imunocheminę analizę su FN9-10 domenui specifiškais antikūnais, patvirtinta rekombinantinio FN9-10 fragmento ekspresija. Atlikus gryninimo eksperimentus, fluorescencinę bei imunocheminę analizę buvo patvirtintas specifinis rekombinantinio baltymo prisijungimas prie nikelio jonų afininės matricos.
Tobacco is widely used as plant-based expression system for producing of antibodies, pharmaceutical and industrial proteins. Production of recombinant proteins in closed system (in vitro) is cost efficient and quality effective alternative for traditional methods. Aim of this research was to develop a closed type cultivation system for production of the recombinant peptide mimicking fibronectin type III 9-10 domain segments (FN9-10) in cultivated tobacco (Nicotiana tabacum) plant tissues. DNA construct based on pDGB3_alpha1 plasmid vector was developed with constant p35S promotor and t35S terminator, including a green fluorescent protein (avGFP) marker for the recombinant protein expression analysis, polyhistidine (6xHis) tag for protein affinity purification and a cleavage site for the WELQut protease for the separation of target peptide. Tobacco leave tissues were transformed using Agrobacterium tumefaciens. Selection of tobacco transformants was carried out using different concentrations of antibiotic and fluorescence of the avGFP marker. By using an avGFP fluorescence and fluorescein diacetate-based cell metabolic activity assay, expression of the recombinant peptide construct in different transformed cell suspension lines was estimated. Expression of recombinant FN9-10 fragments was confirmed using immunoblot analysis with antibodies specific to the FN9-10 domain of fibronectin. Further, purification experiments were carried out and specific binding of the recombinant protein to the nickel-ion affinity matrix was confirmed by using fluorescence and immunoblot analysis.