Kininio žiurkėnuko kiaušidžių ląstelių transfekcijos efektyvumo didinimas, naudojant sinusoidinės bangos ir nanosekundinės trukmės impulsų elektroporaciją
Tyrimo metu tirta CHO ląstelių transfekcija, taikant nanosekundinės trukmės impulsų (nsEP) ir sinusoidinės bangos formos elektroporacijos (sinEP) protokolus. Taip pat tyrimo metu įvertinome transfekcijos efektyvumo priklausomybę nuo prieš procedūrinės 10 minučių inkubacijos 0-4 °C temperatūroje. Ląstelės transfekuotos pEGFP-N1. Transfekcijos efektyvumas įvertintas tekmės citometrijos metodu, vertinant GFP baltymo ekspresiją. Taip pat įvertintas transfekuotų ląstelių skaičius, fluorescencijos pokyčiai ir atkeltų ląstelių skaičius. Ląstelių metabolinis aktyvumas įvertinas PMS/MTS metodu. Tyrimo metu nustatyta, kad prieš nanosekundinės trukmės elektroporaciją ląsteles paveikus sinusinės bangos elektroporacija, transfekuotų ląstelių skaičius gali išaugti 15 %. Vis dėl to šių stebėjimų nepavyko pakartoti, ląsteles prieš procedūrą inkubuojant 10 min. 4 °C temperatūroje. Dėl to atrodo, kad sinEP sukuriamas poveikis yra minamalus, tirtame diapazone (10 kHz; 100 V/cm; 1 min), o transfekcijos ir transgeno ekspresijos efektyvumui yra reikšmingesni tokie veiksniai kaip ląstelių augimo fazė ir temperatūra. Šiuos stebėjimus patvirtina ir tai, kad ląstelių nepavyksta transfekuoti taikant tik sinEP, tirtame parametrų diapazone. Vis dėlto nsEP metodą pavyko patobulinti padidinant transfekcijos efektyvumą (TE) nuo 12,5 % iki 40 %. Tyrimo metu pademnstravome, kad taikant tik nsEP ir ląsteles prieš procedūra inkubuojant ledų vonelėje, bei palaikant ląstelių konfluenciją iki 40 % galima pasiekti 40 % TE, 1,5×106 vidutinę transfekuotos ląstelės fluoresceniją (eTE), tuo pačiu išlaikant metabolį 90% aktyvumą.
In this study, we investigated the transfection of CHO cells using nanosecond pulse duration (nsEP) and sinusoidal waveform pulse (sinEP) electroporation. Additionally, the dependence of transfection efficiency on pre-procedural incubation at 4 °C was assessed. Cells were transfected with the pEGFP-N1 plasmid. Transfection efficiency was evaluated by flow cytometry through the assessment of GFP protein expression. The number of transfected cells, fluorescence intensity changes, and the viability of the transfected cells were analysed using flow cytometry. Cellular metabolic activity was assessed using the PMS/MTS assay. The results demonstrated that applying sinusoidal wave electroporation prior to nanosecond pulse electroporation could increase the number of transfected cells by up to 15%. However, this effect could not be reproduced when cells were pre-incubated for 10 minutes at 4 °C. These findings suggest that the effect of sinEP under the tested conditions (10 kHz, 100 V/cm, 1 min) is minimal, and that factors such as the growth phase and temperature of the cells have a more significant impact on transfection and transgene expression efficiency. This is further supported by the observation that using only sinEP under the tested parameters failed to achieve successful transfection. Nonetheless, the nsEP protocol was successfully optimized, increasing the transfection efficiency (TE) from 12.5% to 40%. In conclusion, we demonstrated that by applying nsEP, pre-incubating the cells in an ice bath, and maintaining cell confluency at approximately 40%, it was possible to achieve a 40% transfection efficiency, an average transfected cell fluorescence (eTE) of 1.5×10⁶, while preserving 90% of cellular metabolic activity.