Thermally Controlled Intein Splicing of DNA Polymerases
Aghakishi, Heydar |
DNR polimerazės modifikavimas naudojant inteino iškirpimą leidžia tiksliai reguliuoti fermento aktyvumą, suteikiant reikšmingų pranašumų molekulinei diagnostikai. Šiame tyrime į Taq DNR polimerazės domeną buvo įterptas termostabilus inteinas, sukuriant temperatūros valdomą fermento variantą. Konstruktas buvo ekspresuotas E. coli ląstelėse ir išgrynintas naudojant afininę chromatografiją. Kaitinant iki 80 °C, inteinas efektyviai išsikerpa ir neaktyvus fermento variantas tampa aktyvia polimeraze. Šis aktyvavimo mechanizmas apsaugo nuo nespecifinio amplifikavimo žemoje temperatūroje ir užtikrina fermentų aktyvaciją padidintoje temperatūroje be išorinių slopiklių. Sujungtas Taq fermentas pasižymėjo geru tirpumu ir stipriu polimerazės aktyvumu, kai tuo tarpu nesujungtos formos išliko neaktyvios. Šis inovatyvus metodas suteikia dinamišką būdą tiksliai reguliuoti DNR polimerazės aktyvumą, siūlydamas universalų įrankį, pritaikomą molekulinės biologijos eksperimentuose ir biotechnologiniuose pasiekimuose.
DNA polymerase engineering through intein splicing enables precise control of enzyme activity, offering significant advantages for molecular diagnostics. In this study, a thermostable intein was inserted into the selected domain of Taq DNA polymerase to create a temperature-regulated variant. The construct was expressed in E. coli and purified using affinity chromatography. The intein was efficiently excised after thermal activation at 80 °C, converting the inactive precursor into a functional enzyme. This activation mechanism prevents nonspecific amplification at lower temperatures, providing a built-in enzyme activation at elevated temperatures without the need for external inhibitors. The spliced Taq variant demonstrated good solubility and maintained polymerase activity, while unspliced forms remained inactive. This innovative approach provides a dynamic means to precisely regulate DNA polymerase activity, offering a versatile tool with applications in molecular biology experimentation and biotechnological advancements.