CHO ir 4T1 ląstelių įjautrinimas elektros impulsais siekiant efektyvesnės pakartotinės mažų molekulių ir genų elektropernašos
Siekiant pagerinti elektroporacijos atlikimo protokolus buvo nustatyta, kad ląstelės, veiktos elektriniais laukais, yra jautresnės pakartotiniams impulsams. Šis efektas pavadintas elektriniu įjautrinimu ir įrodytas net keliose ląstelių linijose, tokiose kaip U937, Jurkat ir CHO. Įjautrinimas pasireiškia veikiant skirtingos trukmės impulsais (60 ns - 100 µs) ir įvairiomis amplitudėmis (1,8 13,3 kV/cm). Remiantis šiuo efektu, reikšmingai padidintas propidžio jodido ir bleomicino elektropernašos efektyvumas (Muratori ir kt., 2016). Nepaisant šių atradimų, nėra standartinės procedūros, kuri gebėtų užtikrinti 100 % bleomicino citotoksiškumą. Elektrochemoterapijos metu išlikusi net mažiausia ląstelių dalis palieka galimybę joms toliau daugintis ir plisti gilyn į organizmą, o vėžio atveju tai gali sukelti atkrytį ar metastazes – pagrindinę nesukontroliuojamo vėžio priežastį (Fan ir kt., 2022). Dėl to šio tyrimo tikslas – ištirti įvairius elektrinio įjautrinimo parametrus, kurie padėtų pagerinti mažų molekulių bei genų pernašą į ląsteles, sustiprinti bleomicino ar kitų citotoksinių medžiagų poveikį ir kartu pernešti genus, koduojančius imuninę sistemą moduliuojančias molekules. Tyrimo metu įvertintas pasirinktų elektrinių laukų poveikis 4T1 ir CHO ląstelių linijų gyvybingumui bei membranos pralaidumo didinimui. Taip pat ištirta galimybė efektyviau pernešti bleomiciną, kalcį ir plazmidinę DNR į CHO ląstelių liniją, atskirai ar kartu su viena iš efektorinių molekulių. Membranos pralaidumo įvertinimui atlikta propidžio jodido elektropernaša. Gyvybingumo rodikliu pasirinkta laikyti ląstelių gebėjimą formuoti kolonijas. Tuo tarpu po kiekvieno elektropernašos eksperimento taip pat įvertintas išlikusių ląstelių kiekis bei metabolinis aktyvumas. Gauti rezultatai parodė, kad sėkmingai atlikus elektrinį įjautrinimą abejose ląstelių linijose, galima padidinti membranos pralaidumą molekulėms, reikšmingai nesumažinant ląstelių gyvybingumo. CHO ląstelių įjautrinimo metu buvo pasiektas reikšmingas mažų molekulių ir plazmidės pernašos į ląsteles padidėjimas, tiek atskirai, tiek kartu. Nepaisant to, kalcis žymiai sumažino transfekcijos efektyvumą, o abiejų molekulių poveikis neužtikrino patikimo poveikio ląstelių metaboliniui aktyvumui ir gebėjimui formuoti kolonijas.
To improve electroporation protocols, it was observed that cells become more sensitive to subsequent pulses after initial exposure to electric fields – a phenomenon known as electrical sensitization. This effect, demonstrated in cell lines such as U937, Jurkat, and CHO, occurs when cells are subjected to pulses of varying durations (60 ns - 100 µs) and amplitudes (1.8 - 13.3 kV/cm). Leveraging this response significantly enhanced the electrotransfer efficiency of propidium iodide and bleomycin (Muratori et al., 2016). Despite these advances, no standardized procedure currently ensures 100% bleomycin cytotoxicity. Even a small population of surviving cells during electrochemotherapy may continue to proliferate and spread deeper into the body, potentially leading to recurrence or metastasis – primary contributors to treatment failure and cancer-related mortality (Fan et al., 2022). Therefore, this study aimed to investigate various electrical sensitization parameters to improve the delivery of small molecules and genes into cells, thereby enhancing the effect of bleomycin or other cytotoxic agents and enabling the co-delivery of genes encoding immune-modulating molecules. This study evaluated the effects of selected electric field parameters on cell viability and membrane permeability in 4T1 and CHO cell lines. It also assessed the efficiency of transferring bleomycin, calcium, and plasmid DNA into CHO cells – either individually or in combination with an effector molecule. Propidium iodide electrotransfer was used to assess changes in membrane permeability, while cell viability was determined by colony formation ability. Additionally, the number of surviving cells and their metabolic activity were analyzed following each electrotransfer procedure. The results showed that effective electrical sensitization increased membrane permeability and molecular uptake without significantly compromising viability in both cell lines. A substantial improvement in the uptake of small molecules and plasmids was observed, both individually and in combination in CHO cells, though calcium reduced transfection efficiency and showed inconsistent effects when combined with plasmid DNA.