Please use this identifier to cite or link to this item:https://hdl.handle.net/20.500.12259/34677
Type of publication: master thesis
Field of Science: Biochemija / Biochemistry (N004)
Author(s): Šulskytė, Indrė
Supervisor: Daugelavičius, Rimantas
Title: Daugiavaisčio atsparumo tyrimai MX-1 ląstelių kultūrose
Other Title: Studies of multidrug resistance pumps in MX-1 cell culture
Extent: 69 p.
Date: 24-May-2017
Event: Vytauto Didžiojo universitetas. Gamtos mokslų fakultetas. Biochemijos katedra
Keywords: Vėžys;Daugiavaistis atsparumas;Tetrafenilfosfonis;Doksorubicinas;Antioksidantai;Kvercetinas
Abstract: Darbo tikslas: Ištirti siurblių įtaką daugiavaisčio atsparumo susiformavime MX-1 ląstelių kultūrose. Tyrimo objektas ir darbo metodika: Tyrimo objektu pasirinktos krūties karcinomos MX-1 ląstelės. Daugiavaisčio atsparumo (DVA) siurblių tyrimai su šia ląstelių linija iki šiol nebuvo atlikti. Siekiant išsiaiškinti DVA susiformavimo prieţasis buvo išvestos naujos MX-1 ląstelių linijos. Naujų linijų išvedimui buvo pasirinkti kultivavimo terpių priedai atsiţvelgiant į jų veikimo mechanizmus ir citotoksinį poveikį. Viena iš tokių medţiagų yra tetrafenilfosfonis (TPP), kuris yra universalus DVA siurblių substratas. Doksorubicinas (DOX) – tai plačiai naudojamas su DNR sąveikaujantis priešvėţinis vaistas. Kvercetinas (Q) – tai antioksidantas flavanoidas, potencialus priešvėţinis vaistas. Rutinas – antioksidantas flavanoidas. Ląstelių linijų išvedimui parinktos maţos (μM) tiriamųjų medţiagų koncentracijos, stabdančios ląstelių augimą. Su pridėto junginio pradine koncentracija ląstelės buvo kultivuojamos tol, kol atsistato proliferacijos greitis. Tada kiekvienos iš medţiagų koncentracijos buvo didinama dvigubai ir tai kartojama tol, kol pasiekiamos medţiagų koncentracijos, neleidţiančios ląstelėms augti įprastu greičiu. Šis procesas reikalavo laiko, uţtruko nuo 1 iki 3 metų. Darbo metu taikyti spektrofotometriniai tyrimo metodai – fluorescenciniai siurblių funkcinio aktyvumo nustatymui ir liuminescenciniai ATP kiekio nustatymui. Ląstelių atsparumo tyrimams taikytas ir MTT testas ląstelių gyvybingumui įvertinti. Rezultatai: Pritaikant atsparių ląstelių išvedimo metodiką pavyko išvesti TPP atsparią ląstelių liniją. Didţiausia TPP koncentracija terpėje, kuriai esant ląstelės dar sugebėjo daugintis, buvo 512 μM, bet tyrimams daugumoje naudota linija MX-1T128, sugebanti augti esant 128 μM TPP. Taip pat buvo išvestos ląstelių linijos, atsparios doksorubicinui (pavadintos MX-1DOX), augančios esant iki 0,08 μM šio chemoterapijai naudojamo vaisto. Greta to buvo suformuotos dvi ląstelių linijos, atsparios antioksidantams: viena atspari 25 μM kvercetinui, o antroji - 200 μM rutinui. Pastarosios linijos ląstelės po kelių persėjimų miršta, todėl detalūs tyrimai su ja nebuvo vykdyti. Atliekant tyrimus su TPP atsparių ląstelių linija nustatyta, kad šiose ląstelėse labai padidėjusi P-glikoproteino raiška ir funkcinis šio siurblio aktyvumas. TPP atsparių ląstelių linija yra ţymiai atsparesnė ir didesnėms doksorubicino, etidţio, nigericino ir monensino koncentracijoms, lyginant su laukinio tipo ląstelėmis. Nustatyta, kad DVA siurblių veiklą galima slopinti 3-brompiruvo rūgštimi maţinant ATP kiekį ląstelėse. Ištyrę DOX ląstelių liniją nustatėme, kad šių ląstelių atsparumas nėra tiesiogiai susijęs su DVA siurbliais. Tai pademonstravo DVA siurblių funkcinio aktyvumo tyrimai: DOX atspariose ląstelėse siurblių veiklos efektyvumas buvo sumaţėjęs lyginant su TPP atsparių ląstelių linija. Atlikę ATP kiekio matavimus pastebėjome, kad aktyvinant siurblių veiklą TPP, ATP kiekis DOX atspariose ląstelėse nesumaţėja. Vertindami DVA siurblių veiklą kvercetinui atspariose (Q) ląstelių linijose, pastebėjome aktyvesnį Et išmetimą, lyginant su laukinio tipo ląstelėse. Padidintą siurblių aktyvumą ląstelių Q linijoje patvirtino ir ATP matavimai, kai siurblių veiklą aktyvavę TPP, pastebėjome ryškų ATP kiekio sumaţėjimą. Tai rodo, kad aktyviai funkcionuojant DVA siurbliams išnaudojamas didelis kiekis ATP. Tolimesnių tyrimų metu įvertintas verapamilo, kaip P-glikoproteino slopiklio, veikimo efektyvumas. Įvertinę gautus rezultatus nustatėme, kad verapamilas slopina minėtąjį siurblį, tačiau tam reikalingos didelės (mM) verapamilo koncentracijos. Išvados: Išvestoje TPP atsparioje ląstelių linijoje labai padidėjusi MDR1 geno raiška. Dėka DVA siurblių šios linijos ląstelės pasiţymi ypatingai dideliu atsparumu tyrime naudotoms medţiagoms. Ląsteles auginant su DOX arba Et nepavyko išvesti linijų, pasiţyminčių dideliu DVA siurblių aktyvumu. Kvercetinas skatina padidintą DVA siurblių aktyvumą Q ląstelių linijoje. DVA siurblių aktyvumą galima nuslopinti 3-brompiruvatu išsekinus viduląstelinį ATP.
The aim of work: To investigate the influence of pumps forming a multidrug resistance at MX-1 cell line. Investigating subjects and methods: Object of this research selected MX-1 breast carcinoma cells line. For research of multidrug resistance (MDR) pumps was derived for anew cell lines. The new cell lines derivation were chosen cell medium additives according to their mechanism of action and cytotoxic effects. One of the all is tetraphenilphosphonium (TPP), which is a unicersal MDR pump substrate. Doxorubicin (DOX) – a widely used with DNA interacting anticancer drug. Quercetin (Q) – antioxidant flavonoid, a pontential anticancer drug. Rutin is also antioxidant flavonoid, with high antioxidant capacity. For cells derivation we selected the low (M) concentration of these agents, suprresed cell growth. With primary additives concentrations cells were incubated as long as the proliferation rated is restored. Then concentration of these agents is rising up at double times and that is repeated until the concentration which inhibit normal cell growth rate is reached. This process required a long period of time from 1 to 3 years. During reasearch we applied spectrophotometric methods – fluorescence for a investigate pump functional activity, and luminiscence for a measurement of ATP concentration in cells. The cells resistance studies we applied to cell viability – MTT test. Results: Applying the method of derivation a resistant cell lines we were form a TPP resistant cell line. The highest achieved TPP concentration in medium, at which the cells are able to proliferate, was – 512 μM, but for a studies we chosen MX-1T128, which can growth with TPP 128 μM concentration in medium. Also derived cell lines which has resistance to doxorubicin (named MX-1DOX) the highest concentration of doxorubicin– 0,08 μM. Also we formed two new cell lines which has resistance for a antioxidants: the first lines is resistant to 25 μM concentration of quercetin and second cell line has resistance to 200 μM concentration of rutin. But the latter cell culture dies after a few recultivation, so a study in this line wasn‘t execute. In studies with TPP resistant cell line we find that this cell line has significantly increased P- glycoprotein expression and functional activity. TPP cell line is substantially resistant to higher concentration of doxorubicin, ethidium bromide, monensin and nigericin compared to wild type. Also we found tha multidrug resistance pumps can be inhibited by depleted the quantity of ATP in cells using 3-brompyuvic acid. Investigated of doxorubicin resistant cell line we found that this cell line is not directly related to MDR pumps. This was shown performing at functipnal activity studies of pumps which DOX cell line pumps activity was diminished compared to TPP cell line. Also for measurement of ATP we found that activation of pump functioning the concentration of ATP in DOX cells is not reduce. Evaluating a formed MDR pumps functional activity at quercetin resistant (Q) cell line we observed increased Et (ethidium bromide) efflux, compared to wild type cell line. The pumps formation of this cell line was confirmed by measurement of ATP, where was activating the pump functional activity using TPP and we found significant decreases of ATP concentration. This indicates that the active functioning of these pumps exploited large amount of ATP. Also we estimated verapamil as a P-glycoprotein inhibitor, effect in Q cell line. The results shown that verapamil is effective inhibit P-gp, but for it require a higher concentration (mM) of verapamil. Conclusions: At derivated TPP resistant cell line is significantly increased expression of MDR1 gene. This cell line has an extremely high resistance for other drugs. Cells growing with DOX and Et can‘t be derived cell lines with hight MDR pump activity. Quercetin promoting the MRD pump activity at Q cell line. 3-brompyruvic acid can inhibit MDR pumps by depleted of the intracellular ATP.
Internet: https://eltalpykla.vdu.lt/1/34677
https://hdl.handle.net/20.500.12259/34677
Appears in Collections:2017 m. (GMF mag.)

Files in This Item:
indre_sulskyte_md.pdf3.18 MBAdobe PDF   Restricted AccessView/Open

Show full item record
Export via OAI-PMH Interface in XML Formats
Export to Other Non-XML Formats


CORE Recommender

Page view(s)

216
checked on Mar 30, 2021

Download(s)

32
checked on Mar 31, 2021

Google ScholarTM

Check


Items in DSpace are protected by copyright, with all rights reserved, unless otherwise indicated.